小鼠子宮平滑肌細胞的分離培養(yǎng)及鑒定＊

范晶晶

（1.濰坊學院，山東 濰坊 261061；2.山東省高校生物化學與分子生物學重點實驗室，山東 濰坊 261061）

子宮肌瘤的發(fā)病率居女性生殖器官良性腫瘤的首位［1］，據(jù)衛(wèi)生部門統(tǒng)計：我國20%～30%成年女性患有子宮肌瘤，每年新發(fā)病人數(shù)在200萬以上［2］。近年研究表明，子宮肌瘤等疾病的病變中主要細胞成份是子宮肌層的平滑肌細胞。小鼠作為實驗室常用實驗動物，培養(yǎng)其子宮平滑肌細胞作為實驗模型，對于研究子宮平滑肌細胞生長、分化、各種致病因素所致子宮病理改變的發(fā)病機制和藥物治療的副作用等方面有著重要意義。由于小鼠子宮類型屬于長雙角子宮［3］，與其它動物相比子宮角直徑小取材量少，采用組織塊貼壁法培養(yǎng)操作難度大、失敗率高，而傳統(tǒng)的酶消化法分離培養(yǎng)的效果差。為了提高小鼠子宮平滑肌細胞原代培養(yǎng)的成功率和可行性，我們在參照國內外文獻報道［4－9］的基礎上，通過對原有的酶消化法進行改良，建立了一種簡單、經濟、快速、細胞純度高的新分離培養(yǎng)方法。

1 材料與方法

1.1 材料

（1）實驗動物：7～8周齡雌性昆明白小鼠購于中國科學院遺傳與發(fā)育所實驗動物中心。

（2）試劑與儀器：胰蛋白酶、Ⅰ型膠原酶、DMEM、F12培養(yǎng)基購于GIBCO公司；青霉素、鏈霉素購于華北制藥有限公司；胎牛血清（FBS）購于杭州四季青生物工程公司；平滑肌肌動蛋白Mouseanti－Actin（英國Novacastra公司），F(xiàn)ITC標記的羊抗鼠IgG（GAM－FITC，美國Zymed公司），Hoechst333258（美國MO公司），其它試劑均為國產分析純。實驗設備包括：普通冰箱、CO2培養(yǎng)箱（Sanyo）、解剖顯微鏡（Motic）、熒光顯微鏡（Leica）、倒置顯微鏡（Leica）、超凈工作臺、高速離心機、恒溫水浴箱，恒溫臺。

1.2 方法

1.2.1 小鼠子宮平滑肌細胞的分離和原代培養(yǎng)

將小鼠麻醉處死，迅速取出子宮放于預冷Hanke’s液（0～4℃）中，沖洗2～3次，以剪刀將周圍組織去除干凈，將子宮外膜用刀片輕輕刮掉，將子宮縱向剖平鋪，內膜面朝上，用鑷子固定住一端，從固定處開始用一次性1mL注射器的針頭（打彎成30°角）作為分離器輕輕將子宮內膜和基質部分刮掉（分離過程見圖1），將內膜和基質去除干凈的子宮平滑肌條剪碎至1mm3，用3mL 0.25%的膠原酶和0.25%胰酶混合消化液37℃水浴震蕩消化1h，2mL有血清DMEM－F12培養(yǎng)液終止消化，吹打數(shù)次，200目細胞篩過濾吸取懸液，再通過400目細胞篩，收集濾液1000rpm／10min離心，基礎培養(yǎng)液洗2次，去除細胞碎片，接種于35mm培養(yǎng)皿中培養(yǎng)。臺盼蘭排斥試驗查細胞存活率大于90%［5］。用20%FCSDMEM－F12培養(yǎng)液，放入37℃、95%濕度、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔3天換一次液。

1.2.2 細胞形態(tài)學觀察

用倒置顯微鏡觀察細胞大小、形態(tài)、排列方式及生長特點等。

1.2.3 免疫細胞化學鑒定

貼壁細胞用預冷PBS洗2遍，4%多聚甲醛固定30min，PBS清洗2遍，－20℃預冷甲醇處理20min，用封閉液1%BSA＋0.2%TritonX－100封閉45min。加入平滑肌肌動蛋白（Mouse anti－Actin，1：50）一抗，4℃過夜。次日平衡至室溫，加FITC標記的二抗室溫孵育2h，用Hoechest33258復染，甘油封片，熒光顯微鏡觀察，暗場下以胞質出現(xiàn)亮綠色為陽性結果，同時計算陽性百分率。

2 結果與分析

2.1 小鼠子宮平滑肌組織的分離與平滑肌細胞原代培養(yǎng)的建立

圖1 子宮平滑肌分離過程

取小鼠的子宮，分離出平滑肌，通過光鏡，對分離過程進行了觀察（見圖1）。采用本文所述的注射器針頭分離方法可以將子宮平滑肌與內膜基質完全分離，為以后保證細胞培養(yǎng)純度做好了基礎。

采用胰酶和Ⅰ型膠原酶混合消化法消化細胞。體外培養(yǎng)3－4天后形成子宮平滑肌細胞單層，約2周后細胞融合成片。倒置相差顯微鏡下觀察單個平滑肌細胞呈梭形或帶狀，有多個細胞突起，胞質豐富，胞質密度高，不透明，平行排列成束，部分重疊，表現(xiàn)為典型的“谷”、“峰”狀生長（見圖2A）。

2.2 子宮平滑肌細胞的免疫細胞化學鑒定

圖2 子宮平滑肌培養(yǎng)及鑒定結果

為了進一步鑒定單層細胞中平滑肌細胞的純度，用平滑肌細胞特異的肌動蛋白（α－Actin）進行免疫熒光染色。染色結果表明：平滑肌細胞肌動蛋白存在于細胞質，綠色熒光為陽性染色，主要分布在胞質區(qū)域。為了進一步統(tǒng)計陽性率，免疫染色后用Hoechst333258對細胞進行復染。細胞核在復染后呈現(xiàn)為藍色，子宮平滑肌細胞呈梭形，胞漿豐富，核大圓形或橢圓形。顯微鏡下隨機選擇6個不同的區(qū)域（×100），數(shù)出單位面積內細胞總數(shù)和α－Actin免疫染色陽性細胞數(shù)。統(tǒng)計結果表明，細胞單層中平滑肌細胞純度在98%以上。

3 討論

子宮平滑肌細胞的收縮、舒張、增殖、纖維化與婦產科疾病密切相關。因此，體外培養(yǎng)子宮平滑肌細胞就成為研究這些疾病及相關藥物藥理的一種重要實驗材料。本研究成功運用自制針頭分離器將平滑肌組織與內膜基層完全分離，并使用膠原酶和胰酶混合消化法、采用20%FCSDMEM／F12培養(yǎng)基對小鼠子宮平滑肌細胞進行體外原代培養(yǎng)，所培養(yǎng)的細胞貼壁生長，呈現(xiàn)梭形、成束的平滑肌細胞平行排列，部分細胞重疊生長達多層，部分區(qū)域可見典型的“峰一谷”樣生長。α－Actin免疫熒光細胞染色陽性，此結果表明所培養(yǎng)的細胞為典型的平滑肌細胞，也說明本方法培養(yǎng)的小鼠子宮平滑肌細胞，雖脫離了原有機體生長環(huán)境，仍具有平滑肌細胞的特性。該分離方法簡單、快速、成本低、易于掌握、分離純度高，細胞增殖迅速。

［1］Parazzini F，Chiafarino F，Polverion G，etal.Uterine fibroids risk and history of selected medical conditions linked with femal hormones［J］.Eur J Epidemiol，2004，19（3）：249－253.

［2］張獻懷.中國成年女性子宮肌瘤年新發(fā)病人數(shù)在200萬以上［N］.人民日報，2011－07－22（海外版）。

［3］Geeene E C.Anatomy of the rat［M］.New York：Hafner Publishing Co，1959.

［4］Ross R.The smooth muscle cell II.Growth of smooth muscle in culture and formation of elastic fibers［J］.Cell Biol，1971，50（1）：172－186.

［5］Casey M L，MacDonald P C，Mitchell M D，etal.Maintenance and characterization of human myometrial smooth muscle cell in monolayer cuhure［J］.In vitro，1984，20（5）：396－403.

［6］黃柏英，張瑜.人子宮平滑肌細胞體外培養(yǎng)［J］.實用預防醫(yī)學，2005，12（3）：479－481.

［7］曾潤清，劉庚貴，劉惠萍，等［J］.兔子宮平滑肌細胞的原代培養(yǎng)與鑒定實用預防醫(yī)學，2007，14（2）：267－269.

［8］錢桂生，李淑平.大鼠細小動脈平滑肌細胞分離培養(yǎng)的新方法［J］.中國臨床解剖學雜志，2000，18（3）：282－283.

［9］司徒鎮(zhèn)強，吳軍正.細胞培養(yǎng)［M］.西安：世界圖書出版西安公司，2004：31.