RNA干擾介導(dǎo)的FAS基因沉默抑制小鼠結(jié)腸癌細胞免疫逃逸的研究*

劉丹 汪涯雅 黃振倩

結(jié)腸癌是常見惡性腫瘤之一，晚期結(jié)腸癌預(yù)后差，Dukes C期的 5年生存率只有30%~60%，而Duckes D期的5年生存率更低至<5%，重要原因在于腫瘤生長早期即可通過局部浸潤、侵襲淋巴管或毛細血管等方式向遠處播散轉(zhuǎn)移，腫瘤的免疫逃逸造成機體免疫系統(tǒng)無法正確識別、清除播散的腫瘤細胞，癌細胞聚集生長并誘導(dǎo)毛細血管增生，最終在肝臟、肺、前列腺及骨等臟器發(fā)展形成轉(zhuǎn)移灶。研究證明機體內(nèi)存在著完善的抗腫瘤免疫監(jiān)視系統(tǒng)和抗腫瘤免疫應(yīng)答。與此同時，腫瘤細胞也進化出了一系列機制逃避宿主的免疫監(jiān)視和攻擊，如共刺激分子表達缺陷，分泌可溶性免疫抑制物質(zhì)等，這就是腫瘤細胞的免疫逃逸。FAS（APO-1/CD95）與FASL（Fasligand）屬于腫瘤壞死因子（TNF）超家族，為細胞凋亡相關(guān)基因，其相互作用可誘導(dǎo)細胞凋亡（Apoptosis），從而維持機體發(fā)育和自身穩(wěn)定所必需的細胞生理性死亡。該系統(tǒng)同時也是機體抗腫瘤免疫的重要組成部分。FAS抗原高表達于機體正常細胞表面，常見腫瘤如消化道腫瘤、肺癌、乳腺癌，均表現(xiàn)為低表達FAS抗原，而高表達FASL抗原。Greeneltch等[1]和Wajant等[2]研究證實腫瘤細胞借助過表達的FasL，通過Fas/FasL途徑誘導(dǎo)抗腫瘤活性淋巴細胞凋亡，抑制腫瘤細胞周圍的腫瘤特異性效應(yīng)T細胞（CTL）、自然殺傷細胞（NK）以及腫瘤浸潤淋巴細胞（TIL），從而逃避機體的免疫識別和免疫攻擊。

本研究構(gòu)建RNA干擾分子載體轉(zhuǎn)染Balb/c小鼠淋巴細胞，降低腫瘤特異性淋巴細胞Fas抗原的表達。采用同種異體淋巴細胞混合培養(yǎng)，觀察不同實驗組中淋巴細胞對結(jié)腸癌細胞的誘導(dǎo)凋亡作用的耐受狀況，探討通過阻斷FAS表達，抑制結(jié)腸癌細胞通過Fas/FasL途徑誘導(dǎo)的抗腫瘤淋巴細胞凋亡作用及其在抗腫瘤免疫中的意義。

1 材料與方法

1.1 細胞培養(yǎng) Bab/c小鼠脾淋巴細胞株及小鼠結(jié)腸癌細胞株（CT26）由暨南大學(xué)李偉教授惠贈。細胞株置于含10%BSA，100 u/ml青霉素，100 μg/ml鏈霉素的RMPI1640培養(yǎng)液中，于5% CO2，37 ℃環(huán)境下培養(yǎng)。

1.2 分子載體構(gòu)建 根 據(jù)NCBI GenBank中小鼠Fas基因cDNA序列（序列號：NM_007987，按照siRNA序列設(shè)計原則，利用Ambion公司設(shè)計軟件，選擇2個靶位點設(shè) 計兩對共四條60bp左右大小的DNA片段，靶位點為716bp-736bp和782bp-802bp，序列如下：第一對正鏈：5’-GATCCATAC ATCCCGAGAATTGCTTTCAAGAGAAGCAATTCTCGGGATGTAT TTTTTTGGAAA-3’；負鏈：5’-AGCTTTTCCAAAAAAATACAT CCCGAGAATTGCTTCTCTTGAAAGCAATTCTCGGGATGTATG-3’。第二對正鏈：5’-GATCCGCATCAAGGAGGGCAAGATATT CAAGAGATATCTTGCCCTCCTTGATGTTTTTTGGAAA-3’；負鏈：5’-AGCTTTTCCAAAAAACATCAAGGAGGGCAAGATAT CTCTTGAATATCTTGCCCTCCTTGATGCG-3’。由上海恒新公司合成引物并克隆至表達載體pSilencer3.0中，即構(gòu)建成Fas基因dsRNA分子表達系統(tǒng)。構(gòu)建完畢后轉(zhuǎn)化受體菌，篩選鑒定挑選表達效率較高組作為研究工具。

1.3 細胞轉(zhuǎn)染 制備的分子載體采用脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染小鼠淋巴細胞。轉(zhuǎn)染48 h后，在培養(yǎng)狀態(tài)下，用倒置熒光顯微鏡觀察細胞生長狀態(tài)及形態(tài)學(xué)改變。在鏡下觀察真核表達質(zhì)粒中增強型綠色熒光蛋白（EGFP）在細胞內(nèi)的表達情況并計算轉(zhuǎn)染效率。

1.4 實驗分組 取對數(shù)生長期的小鼠淋巴細胞105置于培養(yǎng)板中，根據(jù)研究需要將其分為3個組：（1）實驗組：轉(zhuǎn)染研究用質(zhì)粒。（2）陰性對照組：轉(zhuǎn)染空白質(zhì)粒。（3）空白對照組：不做任何轉(zhuǎn)染。

1.5 流式細胞術(shù)檢測各組淋巴細胞FAS/FASL表達水平FITC標(biāo)記兔抗鼠CD95（FAS）抗體及CD174（FASL）購自上海瑞齊生物科技有限公司。細胞培養(yǎng)10 d后經(jīng)胰酶消化，離心收集制成細胞懸液，PBS液洗滌后加入分別上述抗體，4 ℃孵育30 min后以流式細胞儀（Becton Dickinson）檢測FAS/FASL表達。

1.6 同種異體混合淋巴細胞腫瘤細胞培養(yǎng)實驗 取轉(zhuǎn)染對數(shù)生長期CT26細胞接種至6孔板，調(diào)整細胞數(shù)約5×104/孔。隨后按細胞數(shù)5:1比例取不同組對數(shù)生長期淋巴細胞與CT26細胞共培養(yǎng)，72 h后達到檢測條件。

1.7 3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴鹽（MTT）比色法檢測各組淋巴細胞增殖生長情況 以生理鹽水制備終濃度為5 mg/ml的MTT溶液，胰酶消化對數(shù)期細胞，終止后離心收集，制成細胞懸液，細胞計數(shù)調(diào)整其濃度至（5~10）×104/ml，接種至96孔培養(yǎng)板，5% CO2，37 ℃孵育48 h。每孔加入 10 μl MTT溶液（5 mg/ml，即 0.5% MTT），繼續(xù)培養(yǎng)4 h后終止培養(yǎng)，吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液。每孔加入150 μl二甲基亞砜（DMSO），振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解。選擇490 nm波長，在酶聯(lián)免疫檢測儀上測定各孔光吸收值，記錄結(jié)果。

1.8 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 11.0進行統(tǒng)計分析，計量資料以（s）表示，組間比較采用t檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 流式細胞術(shù)檢測不同時期各組淋巴細胞表達FAS/FASL抗原情況 在細胞培養(yǎng)+15 d分別取各組淋巴細胞，制備細胞懸液并以FITC標(biāo)記的CD95（FAS）抗體及CD174（FASL）抗體孵育，流式細胞術(shù)檢測其表面FAS、FASL表達。研究發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染RNA干擾分子載體實驗組淋巴細胞表面FAS（CD95）表達水平明顯下降，與陰性對照組及空白對照組比較存在統(tǒng)計學(xué)差異（P<0.05或P<0.01），證實實驗組淋巴細胞FAS抗原表達被RNA干擾載體抑制。FASL（CD174）表達陽性率與陰性對照組及空白對照組間無明顯差異（P>0.05）。陰性對照組與空白對照組間FAS、FASL表達率無明顯差異（P>0.05）。見表1、圖1。

表1 各組淋巴細胞表面FAS、FASL表達陽性率分析

圖1 各組淋巴細胞表面FAS、FASL表達陽性率

2.2 MTT法檢測各組淋巴細胞生長情況 在細胞培養(yǎng)+5 d、+10 d、+15 d、+20 d分別取各組淋巴細胞經(jīng)MTT比色法檢測其吸光度值（OD），分析細胞生長增殖情況。研究發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染RNA干擾分子載體實驗組淋巴細胞在培養(yǎng)至+10 d以后其增殖速度明顯快于陰性對照組（僅轉(zhuǎn)染空白質(zhì)粒）及空白對照組（未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒）。+15 d及+20 d監(jiān)測OD值與陰性對照組及空白對照組比較差異存在統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05或P<0.01），陰性對照組與空白對照組間細胞增殖速度無明顯差異。見表2、圖2。

表2 各組淋巴細胞在各時間點吸光度測量值（s）

表2 各組淋巴細胞在各時間點吸光度測量值（s）

*與陰性對照組及空白對照組比較，P<0.05；△與陰性對照組及空白對照組比較，P<0.01

實驗組 1.40±0.15 2.89±0.24 5.60±1.41*10.17±2.53*△陰性對照組 1.29±0.27 1.80±0.64 3.21±0.72 5.16±1.03空白對照組 1.24±0.13 1.38±0.39 2.19±0.95 4.29±1.69

圖2 各組CT26細胞的生長曲線

3 討論

Fas/FasL系統(tǒng)是細胞凋亡的重要信號傳導(dǎo)系統(tǒng)之一，它既是機體重要的抗腫瘤免疫效應(yīng)機制，也是腫瘤細胞誘發(fā)免疫逃逸的重要作用位點。目前關(guān)于Fas/FasL系統(tǒng)與腫瘤免疫逃逸的關(guān)系的研究主要集中于評價腫瘤細胞Fas抗原表達的下降和（或）FasL表達的增加在免疫逃逸中的地位和作用以及參與腫瘤細胞免疫逃逸的機制。目前認為Fas/FasL系統(tǒng)是結(jié)腸腫瘤細胞逃避宿主免疫監(jiān)視或免疫殺傷的主要機制。Petak等[3]報道發(fā)現(xiàn)結(jié)腸癌組織可通過Fas基因突變來改變Fas啟動凋亡的傳遞途徑和干擾凋亡信號的傳導(dǎo)，降低結(jié)腸癌細胞對T淋巴細胞FasL的敏感性，可能的機制：（1）凋亡抑制基因的高表達，如bcl-2和FAP-1。（2）血清sFasL（soluable Fas）水平升高，sFas區(qū)別于Fas之處在于，sFas分子跨膜區(qū)有363個bp缺失，使sFas分子跨膜區(qū)的17個氨基酸和膜外區(qū)5個氨基酸丟失，由于翻譯產(chǎn)物缺乏跨膜區(qū)而呈可溶性分泌，結(jié)腸癌細胞分泌的sFas 與淋巴細胞表面的FasL結(jié)合可競爭性抑制結(jié)腸癌細胞與淋巴細胞表面的FasL結(jié)合，通過此途徑抑制Fas介導(dǎo)的細胞凋亡。（3）產(chǎn)生FADD樣的FLICE的抑制蛋白（FKIP）。（4）凋亡抑制因子家族成員上調(diào)。Fas基因改變導(dǎo)致Fas表達下調(diào)，使Fas介導(dǎo)細胞凋亡功能喪失，從而阻止結(jié)腸癌細胞凋亡。Song等[4]報道證實結(jié)腸腫瘤患者外周血存在高濃度、高效價的可溶性FasL（sFasL）分子，參與對結(jié)腸腫瘤患者全身免疫系統(tǒng)的抑制作用和組織損傷過程。該研究證實結(jié)腸腫瘤細胞在進入循環(huán)系統(tǒng)時產(chǎn)生和釋放sFasL可使表達Fas抗原的細胞凋亡，也可以誘導(dǎo)激活T細胞的凋亡，使腫瘤細胞更易增殖并轉(zhuǎn)移。今年來的文獻報道抗FAS單克隆抗體（CH11）在結(jié)腸癌、乳腺癌、急性白血病等多種腫瘤的體外實驗中已經(jīng)被證實能夠有效降低細胞膜FAS水平[5-6]，可以明顯抑制腫瘤特異性免疫細胞的凋亡[7]，本次研究證實以RNA干擾技術(shù)沉默淋巴細胞FAS基因表達，可以明顯減少細胞膜FAS抗原表達，從而封閉結(jié)腸癌細胞通過FAS/FASL對淋巴細胞的誘導(dǎo)凋亡作用，為抗腫瘤免疫效應(yīng)研究提供了有價值的實驗資料，并可為結(jié)腸腫瘤的生物治療提供新的技術(shù)途徑。

[1]Greeneltch K M，Schneider M，Steinberg S M，et al.Host immunosurveillance controls tumor growth via IFN regulatory factor-8 dependent mechanisms[J].Cancer Res，2007，67（21）:10406-10416.

[2]Wajant H.CD95L/FasL and TRAIL in tumour surveillance and cancer therapy[J].Cancer Treat Res，2006，130（1）:141-165.

[3]Petak I，Tillman D M，Harwood F G，et al.Fas dependent and independent mechanisms of cell death following DNA damage inhuman colon carcinoma cells[J].Cancer Res，2000，60（10）:2643-2650.

[4]Song E，Chen J，Ouyang N，et al.Soluble Fas ligand released by colon adenocarcinoma cells induces host lymphocyte apoptosis:an active mode of immune evasion in colon cancer[J].Br J Cancer，2001，85（7）:1047-1054.

[5]Mody M，Dharker N，Bloomston M，et al.Rosiglitazone sensitizes MDA-MB-231 breast cancer cells to anti-tumour effects of tumour necrosis factor-alpha，CH11 and CYC202[J].Endocr Relat Cancer，2007，14（2）:305-315.

[6]Chen J，Zhang H，Su F，et al.Cytokine associated sensitivity of colon carcinoma cells to FasR-mediated cytotoxicity of CTL[J].Asian J Surg，2002，25（1）:89-97.

[7]Iorns E，Lord C J，Turner N，et al.Utilizing RNA interference to enhance cancer drug discovery[J].Nat Rev Drug Discov，2007，6（7）:556-568.