幼建鯉生物素缺乏的病理組織學(xué)觀察

趙 姝馮 琳，2，3劉 揚(yáng)，2，3姜 俊，2，3周小秋，2，3*

(1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物營養(yǎng)研究所，雅安 625014;2.動(dòng)物抗病營養(yǎng)四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，雅安 625014;3.魚類營養(yǎng)與安全生產(chǎn)四川省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，雅安 625014)

生物素是魚類正常生理活動(dòng)所必需的營養(yǎng)物質(zhì)［1］。在動(dòng)物體內(nèi)，生物素主要作為羧化酶的輔酶，參與氨基酸、脂類和碳水化合物的代謝［2］。目前，有關(guān)生物素對(duì)魚類影響的研究主要集中在生長性能方面。研究表明，飼料中補(bǔ)充生物素可提高鯉魚［1］、羅非魚［3］和鱸魚［4］等魚類的生長性能，提高鯰魚［5］的魚體蛋白質(zhì)和脂肪含量;而生物素缺乏可導(dǎo)致鯰魚［5］、建鯉［6］的皮膚顏色變深。關(guān)于生物素缺乏對(duì)魚類組織器官病理變化的研究僅見少量報(bào)道。研究發(fā)現(xiàn)，生物素缺乏可導(dǎo)致鯉魚［1］和虹鱒［7］的鰓葉上皮細(xì)胞肥大、增生。本文擬通過飼喂幼建鯉生物素缺乏飼料，觀察其對(duì)幼建鯉腸道、肝臟、后腎、鰓等組織器官結(jié)構(gòu)的影響，旨在為生物素缺乏對(duì)魚類組織器官病理變化的研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)飼料

試驗(yàn)飼料是以酪蛋白和明膠等作為主要蛋白質(zhì)源的純化飼料。缺乏組飼料不添加生物素，其生物素實(shí)測(cè)值為0.010 mg/kg，對(duì)照組飼料生物素添加量按本課題組前期試驗(yàn)得出的理論需要量(0.150 mg/kg)［6］添 加，其生物素實(shí)測(cè)值為0.151 mg/kg。試驗(yàn)飼料中維生素B1添加量參考文獻(xiàn)［8］，維生素 B2添加量參考文獻(xiàn)［9］，蛋氨酸［10］、賴 氨 酸［11］、維 生 素 B6［12］、泛 酸［13］、煙

酸［14］、肌醇［15］、鐵［16］和鋅［17］的添加量參照本課題組確定的幼建鯉需要量。其他營養(yǎng)素的添加量參照NRC(1993)［18］鯉魚營養(yǎng)需要標(biāo)準(zhǔn)。試驗(yàn)飼料組成及營養(yǎng)水平見表1。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與飼養(yǎng)管理

試驗(yàn)在四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物營養(yǎng)研究所水生動(dòng)物營養(yǎng)試驗(yàn)場(chǎng)進(jìn)行。魚苗自通威原(良)種漁場(chǎng)購回后，用0.8%氯化鈉消毒，浸泡12 h后換水。經(jīng)10 d馴化和28 d耗竭試驗(yàn)后，選擇初始均重為(7.72±0.02)g的健康幼建鯉 400尾，隨機(jī)分成2組(缺乏組和對(duì)照組)，每組4個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)50尾魚，組間初始均重差異不顯著(P＞0.05)。試驗(yàn)魚以重復(fù)為單位飼養(yǎng)于循環(huán)流水過濾水族箱(90 cm×30 cm×40 cm)中。耗竭試驗(yàn)結(jié)束后，開始63 d的正式飼養(yǎng)試驗(yàn)。試驗(yàn)期間水溫和pH分別保持在(23±2) ℃和 7.0±0.3，溶氧保持在5.0 mg/L以上，每15 d用0.8%氯化鈉對(duì)水體消毒1次。正式飼養(yǎng)試驗(yàn)1～4周每天投喂6次，5～9周每天投喂4次。

表1 試驗(yàn)飼料組成及營養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))Table 1 Composition and nutrient levels of experimental diets(air-dry basis) %

1.3 病理組織學(xué)觀察

試驗(yàn)結(jié)束后，每重復(fù)隨機(jī)選取5尾魚，取出腸道(分為前腸、中腸、后腸3段)、肝胰臟、后腎、心臟、肌肉和鰓絲，用100 mL/L的中性福爾馬林溶液固定，石蠟包埋，切片，蘇木精－伊紅(HE)常規(guī)染色，并在倒置顯微鏡下觀察組織病理變化。

2 結(jié)果

2.1 生物素缺乏引起的幼建鯉腸道組織病理變化

缺乏組魚的各腸段腸黏膜上皮細(xì)胞變性、壞死、脫落，前腸、中腸部分腸黏膜上皮細(xì)胞脫落至腸腔;前腸、中腸和后腸的皺襞較低，排列稀疏，中腸和后腸的部分皺襞發(fā)生粘連，呈寬而短的舌狀(圖1－1、圖1－2、圖1－3)。對(duì)照組魚的各腸段腸黏膜上皮細(xì)胞排列整齊、緊密，皺襞較高，呈細(xì)而長的指狀，未見異常(圖1－4、圖1－5、圖1－6)。

2.2 生物素缺乏引起的幼建鯉肝臟、后腎和心臟組織病理變化

肝臟：缺乏組魚的肝細(xì)胞顆粒變性或空泡變性，變性的肝細(xì)胞腫脹，細(xì)胞界限模糊，胞漿染色變淡或幾乎透明，細(xì)胞核懸浮于細(xì)胞內(nèi)或溶解(圖1－7)。對(duì)照組魚的肝細(xì)胞排列緊密，細(xì)胞界限清晰，細(xì)胞核均勻分布在細(xì)胞的中央，未見異常(圖1－8)。

后腎：缺乏組魚的后腎腎小管細(xì)胞變性、腫脹，胞漿染色不均勻，部分變淡甚至透明，有空泡出現(xiàn)，細(xì)胞核排列較散亂(圖1－9)。對(duì)照組魚的后腎腎小管細(xì)胞排列緊密，界限較清楚，胞漿染色均勻，細(xì)胞核均勻分布在細(xì)胞的中央，未見異常(圖1－10)。

心臟：缺乏組魚的心臟肌纖維溶解、斷裂，肌間間隙變寬(圖1－11)。對(duì)照組魚的心臟肌纖維結(jié)構(gòu)完整，排列致密，未見異常(圖1－12)。

2.3 生物素缺乏引起的幼建鯉肌肉和鰓絲組織病理變化

肌肉：缺乏組魚的肌肉肌纖維排列散亂，部分肌纖維萎縮、溶解或斷裂，肌橫紋模糊不清或消失，其內(nèi)形成空洞，胞漿淡染，細(xì)胞核濃縮、破裂或溶解(圖1－13)。對(duì)照組魚的肌肉肌纖維結(jié)構(gòu)完整，排列緊密，細(xì)胞核分布在肌纖維的邊緣，未見異常(圖1－14)。

鰓絲：缺乏組魚的鰓絲粗短，排列不整齊，部分鰓絲裂解、脫落，嚴(yán)重者從鰓弓處發(fā)生斷裂;鰓小片粘連在一起，嚴(yán)重者鰓小片壞死、脫落，部分鰓弓處發(fā)生充血，軟骨消失(圖1－15)。對(duì)照組魚的鰓絲細(xì)長，排列整齊，結(jié)構(gòu)完整(圖1－16)。

3 討論

關(guān)于生物素缺乏對(duì)魚類腸道組織病理變化的研究尚未見報(bào)道。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，生物素缺乏使得幼建鯉腸道黏膜上皮細(xì)胞變性、壞死、脫落。Robinson等［19］研究報(bào)道，生物素缺乏斑點(diǎn)叉尾的肝臟重量降低，推測(cè)生物素缺乏導(dǎo)致肝臟重量降低的原因可能是生物素缺乏狀態(tài)下肝臟氧化加速，結(jié)構(gòu)受到破壞，使其生長受阻。本試驗(yàn)中，幼建鯉生物素缺乏導(dǎo)致肝細(xì)胞變性、腫脹，細(xì)胞界限模糊，胞漿染色變淡。這可能是因?yàn)樯锼厝狈κ刽~類肝臟中多不飽和脂肪酸含量升高，加劇了活性氧物質(zhì)對(duì)肝細(xì)胞的攻擊，進(jìn)而產(chǎn)生氧化應(yīng)激［20］。在溪紅點(diǎn)鮭上的研究發(fā)現(xiàn)，生物素缺乏提高了其肝臟中亞油酸(屬于多不飽和脂肪酸的一種)的含量［21］。本試驗(yàn)中，在幼建鯉其他內(nèi)臟器官上的研究發(fā)現(xiàn)，生物素缺乏導(dǎo)致后腎和心臟均出現(xiàn)不同程度的病理變化。

關(guān)于生物素缺乏對(duì)魚類肌肉組織病理變化的研究未見報(bào)道。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，生物素缺乏導(dǎo)致幼建鯉的肌纖維萎縮、斷裂，肌橫紋消失，形成空洞。Shaw等［22］研究發(fā)現(xiàn)，生物素缺乏導(dǎo)致大鼠肌纖維萎縮，肌橫紋模糊。磷脂是參與魚類生物膜構(gòu)成的必需物質(zhì)，形成膜抗氧化的第1道防線。Poston等［21］研究發(fā)現(xiàn)，生物素缺乏影響溪紅點(diǎn)鮭體內(nèi)磷脂的脂肪酸組成。由此推測(cè)，生物素缺乏會(huì)造成魚體內(nèi)生物膜系統(tǒng)損傷，使細(xì)胞膜上蛋白質(zhì)的空間構(gòu)型發(fā)生改變，不能正常交換營養(yǎng)物質(zhì)，進(jìn)而導(dǎo)致肌肉細(xì)胞變性、壞死。

鰓是魚類的主要呼吸器官。研究表明，生物素缺乏可引起普通鯉魚的鰓葉上皮細(xì)胞肥大，鰓葉產(chǎn)生粘連［1］;虹鱒的鰓小片縮短、增厚，鰓葉上皮細(xì)胞肥大、增生［7］。本試驗(yàn)中，生物素缺乏導(dǎo)致幼建鯉的鰓小片粘連，鰓絲裂解、脫落，這與在其他魚類上的報(bào)道一致。

圖1 幼建鯉生物素缺乏的病理組織學(xué)觀察Fig.1 Histopathological observation of juvenile Jian carp with biotin deficiency

4 結(jié)論

生物素缺乏可導(dǎo)致幼建鯉腸道、肝臟、后腎、心臟、肌肉和鰓絲出現(xiàn)不同程度的病理損傷。

［1］OGINO C，WATANABE T，KAKINO J，et al.B vitamin requirements of carp.Ⅲ.Requirement of biotin［J］.Bulletin of the Japanese Society of Scientific Fisheries，1970，36：734 －740.

［2］ZEMPLENI J，WIJERATNE S S K，HASSAN Y I.Biotin［J］.BioFactors，2009，35(1)：36 －46.

［3］SHIAU S Y，CHIN Y H.Estimation of the dietary biotin requirement of juvenile hybrid tilapia，Oreochromis niloticus × O.aureus［J］.Aquaculture，1999，170(1)：71 －78.

［4］LI J，ZHANG L，MAI K，et al.Estimation of dietary biotin requirement of Japanese seabass，Lateolabrax japonicus C.［J］.Aquaculture Nutrition，2010，16(3)：231 －236.

［5］MOHAMED J S.Dietary biotin requirement deter-mined forIndian catfish，Heteropneustesfossilis(Bloch)，fingerlings［J］.Aquaculture Research，2001，32(9)：709 －716.

［6］ZHAO S，F(xiàn)ENG L，LIU Y，et al.Effect of dietary biotin supplement on growth，body composition and intestinal enzyme activities and microbiota of juvenile Jian carp(Cyprinus carpio var.Jian)［J］.Aquaculture Nutrition，2011.doi：10.1111/j.1365 － 2095.2011.00905.x.

［7］CASTLEDINE A J，CHO C Y，SLINGER S J，et al.Influence of dietary biotin level on growth，metabolism and pathology of rainbow trout［J］.The Journal of Nutrition，1978，108(4)：698 －711.

［8］HUANG H H，F(xiàn)ENG L，LIU Y，et al.Effects of dietary thiamin supplement on growth，body composition and intestinal enzyme activities of juvenile Jian carp(Cyprinus carpio var.Jian)［J］.Aquaculture Nutrition，2011，17(2)：233 －240.

［9］LI W，ZHOU X Q，F(xiàn)ENG L，et al.Effect of dietary riboflavin on growth，feed utilization，body composition and intestinal enzyme activities of juvenile Jian carp(Cyprinus carpio var.Jian)［J］.Aquaculture Nutrition，2010，16(2)：137 －143.

［10］帥柯.蛋氨酸對(duì)幼建鯉消化功能和免疫功能的影響［D］.碩士學(xué)位論文.雅安：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)，2006.

［11］趙春蓉.賴氨酸對(duì)幼建鯉消化功能和免疫功能的影響［D］.碩士學(xué)位論文.雅安：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)，2005.

［12］HE W，ZHOU X Q，F(xiàn)ENG L，et al.Dietary pyridoxine requirement of juvenile Jian carp(Cyprinus carpio var.Jian)［J］.Aquaculture Nutrition，2009，15：402 －408.

［13］WEN Z P，F(xiàn)ENG L，JIANG J，et al.Immune response，disease resistance and intestinal microflora of juvenile Jian carp(Cyprinus carpio var.Jian)fed graded levels of pantothenic acid［J］.Aquaculture Nutrition，2010，16：430 －436.

［14］向陽.煙酸對(duì)幼建鯉消化功能和免疫功能的影響［D］.碩士學(xué)位論文.雅安：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)，2008.

［15］JIANG W D，F(xiàn)ENG L，LIU Y，et al.Growth，digestive capacity and intestinal microflora of juvenile Jian carp(Cyprinus carpio var.Jian)fed graded levels of dietary inositol［J］.Aquaculture Research，2009，40：955 －962.

［16］LING J，F(xiàn)ENG L，LIU Y，et al.Effect of dietary iron levels on growth，body composition and intestinal enzyme activities of juvenile Jian carp(Cyprinus carpio var.Jian)［J］.Aquaculture Nutrition，2010，16：616 －624.

［17］TAN L N，F(xiàn)ENG L，LIU Y，et al.Growth，body composition and intestinal enzyme activities of juvenile Jian carp(Cyprinus carpio var.Jian)fed graded levels of dietary zinc［J］.Aquaculture Nutrition，2011，17(3)：338 －345.

［18］NRC.Nutrient requirements of fish［S］.Washington，D.C.：National Academies Press，1993.

［19］ROBINSON E H，LOVELL R T.Essentiality of biotin for channel catfish(Ictalurus punctatus)fed lipid and lipid-free diets［J］.The Journal of Nutrition，1978，108(10)：1600 －1605.

［20］MUNASINGHE D M S，OHKUBO T，SAKAI T.The lipid peroxidation induced changes of protein in refrigerated yellowtail minced meat［J］.Fisheries Science，2005，71(2)：462 －464.

［21］POSTON H A，MCCARTNEY T H.Effect of Dietary biotin and lipid on growth，stamina，lipid metabolism and biotin-containing enzymes in brook trout(Salvelinus fontinalis)［J］.The Journal of Nutrition，1974，104(3)：315 －322.

［22］SHAW J H，PHILLIPS P H.Pathological studies of acute biotin deficiency in the rat［J］.Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine，1942，51(3)：406 －407.