不同外源寡糖對嶗山奶山羊瘤胃微生物區(qū)系的影響

祁 茹溫建新程 明汪文鑫肖 宇褚永康林英庭*

(1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，青島 266109;2.青島市畜牧獸醫(yī)研究所，青島 266100)

外源寡糖(又稱低聚糖)作為一種新型的微生態(tài)飼料添加劑，用量少、純天然、無殘留且穩(wěn)定性強，具有吸附腸道病原菌和發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用的雙重功能，最有可能成為抗生素的替代品。目前國內(nèi)外關(guān)于寡糖添加效果的報道不一。Davis等［4］和 Pettigrew［5］研究發(fā)現(xiàn)，甘露寡糖(mannoseoligosaccharides)在豬體內(nèi)如同其他抗菌生長促進劑一樣有效，然而也有報道認(rèn)為并無該效果［6－8］。Liu等［9］報道殼聚糖(飼糧添加160 mg/kg)有降低斷奶仔豬腹瀉率、抑制大腸桿菌生長的功效，但不能有效替代抗生素作為斷奶仔豬生長促進劑使用。Dimitroglou等［10］報道，MOS調(diào)節(jié)虹鱒魚腸道微生物群落，進而作用于腸道形態(tài)和上皮細胞刷狀緣。王新峰等［2］研究寡糖對斷奶羔羊瘤胃菌群的影響，結(jié)果表明寡糖能夠改變斷奶羔羊瘤胃菌群結(jié)構(gòu)，其中果寡糖(fructo-oligosaccharides)(飼糧添加0.3%)對羔羊瘤胃液細菌總數(shù)以及黃化瘤胃球菌(R.Flavefaciens)和琥珀酸絲狀桿菌(F.Succinogenes)數(shù)量均有提高作用。外源寡糖在奶山羊的報道較少，關(guān)于比較不同外源寡糖作用效果的研究亦極少。因此，本試驗通過在飼糧中添加不同外源寡糖，研究其對瘤胃微生物區(qū)系的影響，篩選和確定奶山羊用寡糖，為外源寡糖應(yīng)用于奶山羊養(yǎng)殖提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

甘露寡糖(純度50%)、半乳甘露寡糖(galactomannan-oligosaccharides，純 度 80%)、寡 木 糖(xylo-oligosaccharides，純度70%)、低聚異麥芽寡糖(isomalto-oligosaccharides，純度 90%)、果寡糖(純度90%)均為商業(yè)產(chǎn)品。

1.2 試驗動物及分組

選用體況良好、平均體重(32.80 ±2.45)kg、安裝有永久性瘤胃瘺管的6月齡去勢嶗山奶山羊6只，進行編號。采用分期分組試驗設(shè)計，試驗共4期，每期奶山羊分別飼喂基礎(chǔ)飼糧以及基礎(chǔ)飼糧中添加1%(以有效含量計)不同外源寡糖的試驗飼糧，按添加寡糖的種類將各期中的試羊分配到6組，試驗動物分組見表1。每期23 d，其中預(yù)試期14 d，正試期 9 d。

1.3 基礎(chǔ)飼糧

基礎(chǔ)飼糧配制參照中國肉用山羊飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)(NY/T 816—2004)［11］，基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平見表2。

表1 試驗動物分組Table 1 Grouping of experimental animals

表2 基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))Table 2 Composition and nutrient levels of the basal diet(air-dry basis) %

1.4 飼養(yǎng)管理

試驗期間奶山羊單欄飼養(yǎng)，每天07：00和17：00分2次等量飼喂，先精后粗，精飼料425 g/d，粗飼料1 000 g/d，自由飲水，各組間飼養(yǎng)管理完全一致。

1.5 瘤胃內(nèi)容物的采集和預(yù)處理

瘤胃內(nèi)容物的采集時間如下：正試期第1天07：00(0 h)、13：00(6 h);第 5 天 09：00(2 h)、15：00(8 h);第 9 天 11：00(4 h)、17：00(10 h)。

由瘤胃瘺管采集不同位點的瘤胃內(nèi)容物，立刻用4層紗布過濾，取5 mL裝入充有CO2氣體的離心管，在超凈工作臺中梯度稀釋并接種培養(yǎng)，用于瘤胃液單位體積內(nèi)細菌、真菌、纖維素分解菌的計數(shù)。再取1 mL加入4 mL甲基綠染色液(MFS)中固定，以備鏡檢原蟲數(shù)。

1.6 細菌、真菌、纖維素分解菌和原蟲的計數(shù)

1.6.1 細菌、真菌、纖維素分解菌計數(shù)

細菌、真菌、纖維素分解菌采用固體培養(yǎng)基培養(yǎng)后計數(shù)，參照Hungate［12］的滾管法進行。

1.6.2 原蟲計數(shù)

原蟲計數(shù)參照《現(xiàn)代反芻動物營養(yǎng)研究方法和技術(shù)》［13］進行。

1.7 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計分析應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計分析軟件中的One-way ANOVA進行方差分析，LSD進行多重比較，采用回歸的曲線估計進行回歸分析。結(jié)果均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果

2.1 不同外源寡糖對瘤胃液細菌總數(shù)的影響

由表3可知，與對照組相比，瘤胃液單位體積內(nèi)細菌總數(shù)在晨飼前(0 h)僅MOS組顯著提高(P＜0.05)，其余試驗組有提高的趨勢，但未達到顯著水平(P＞0.05);各試驗組細菌總數(shù)在晨飼后2 h降到最低，所有組均在晨飼后4 h達到峰值，然后緩慢下降，趨于平衡。在整個試驗期內(nèi)，MOS組、FOS組的瘤胃液單位體積內(nèi)細菌總數(shù)處于較高水平。

2.2 不同外源寡糖對瘤胃液纖維素分解菌數(shù)量的影響

由表4可知，晨飼前MOS組瘤胃液單位體積內(nèi)纖維素分解菌數(shù)量較對照組顯著提高(P＜0.05);GMOS組、FOS組在晨飼前，晨飼后 2、4 h均顯著高于對照組和其他試驗組(P＜0.05)，它們之間差異不顯著(P＞0.05)。各組均出現(xiàn)先升高后降低的趨勢，晨飼后4 h達到峰值，然后逐漸降低。整個試驗期內(nèi)，GMOS組、FOS組的瘤胃液單位體積內(nèi)纖維素分解菌數(shù)量一直處于較高水平。

表3 不同外源寡糖對瘤胃液細菌總數(shù)動態(tài)變化的影響Table 3 Effects of different exogenous oligosaccharides on the dynamic change of number of total bacteria in rumen liquid 109CFU/mL

表4 不同外源寡糖對瘤胃液纖維素分解菌數(shù)量動態(tài)變化的影響Table 4 Effects of different exogenous oligosaccharides on the dynamic change of number of rumen liquid cellulose-decomposing bacteria 108CFU/mL

由表5可知，瘤胃液單位體積內(nèi)纖維素分解菌數(shù)量和時間的回歸關(guān)系符合二次曲線模型，各試驗組的瘤胃液單位體積內(nèi)纖維素分解菌數(shù)量極小值均高于對照組，提示飼糧中添加外源寡糖可以提高奶山羊瘤胃液單位體積內(nèi)纖維素分解菌數(shù)量。GMOS組和FOS組取極小值時的時間(即對稱軸數(shù)值)均高于對照組，提示添加半乳甘露寡糖和果寡糖延遲了瘤胃液單位體積內(nèi)纖維素分解菌到達峰值的時間，即增加了較高濃度纖維素分解菌作用于瘤胃內(nèi)容物的時間，且極小值也高于對照組。

表5 瘤胃液纖維素分解菌數(shù)量與時間的回歸分析Table 5 The regression analysis of number of rumen liquid cellulose-decomposing bacteria and time

2.3 不同外源寡糖對瘤胃液原蟲數(shù)量的影響

由表6可知，與對照組瘤胃液單位體積內(nèi)原蟲數(shù)量相比，MOS組在晨飼后2和4 h、XOS組在晨飼后4 h均顯著增加(P＜0.05);整個試驗期內(nèi)，MOS組瘤胃液原蟲數(shù)量處于較高水平;各組原蟲數(shù)量呈先下降后上升趨勢，晨飼后2 h下降到最低點，之后開始上升，MOS組和XOS組晨飼后4 h達到峰值，其余組到晨飼后6 h達到峰值，之后逐漸下降或趨于平衡。晚飼前(晨飼后10 h)瘤胃液原蟲數(shù)量恢復(fù)到和晨飼前同一水平。

表6 不同外源寡糖對瘤胃液原蟲數(shù)量動態(tài)變化的影響Table 6 Effects of different exogenous oligosaccharides on the dynamic change of number of rumen liquid protozoa 105CFU/mL

由表7可知，瘤胃液單位體積內(nèi)原蟲數(shù)量和時間的回歸關(guān)系符合二次曲線模型，各試驗組的瘤胃液原蟲數(shù)量極大值均高于對照組，即飼糧中添加外源寡糖可以提高奶山羊瘤胃液原蟲數(shù)量。

2.4 不同外源寡糖對瘤胃液真菌數(shù)量的影響

由表8可知，與對照組瘤胃液單位體積內(nèi)真菌數(shù)量相比，晨飼前GMOS組(P＜0.01)和FOS組(P ＜0.01)，晨飼后 2 h MOS組(P ＜0.05)、IMO 組(P ＜0.05)、FOS組(P ＜0.05)，晨喂后4 h MOS組(P ＜0.05)，晨飼后6 h FOS組(P ＜0.05)均有顯著提高。各試驗組瘤胃液真菌數(shù)量在晨飼后呈上升趨勢，到4 h達到峰值，然后逐漸下降，在晨飼后8 h略有升高，而后晚飼前有所降低。在整個試驗期內(nèi)，MOS組、FOS組的瘤胃液真菌數(shù)量在各試驗組間均一直處于較高水平。

表7 瘤胃液原蟲數(shù)量與時間的回歸分析Table 7 The regression analysis of number of rumen liquid protozoa and time

表8 不同外源寡糖對瘤胃液真菌數(shù)量動態(tài)變化的影響Table 8 Effects of different exogenous oligosaccharides on the dynamic change of number of rumen liquid fungi 105CFU/mL

從表9可知，瘤胃液單位體積內(nèi)真菌數(shù)量和時間的回歸關(guān)系符合二次曲線模型，各試驗組回歸方程的對稱軸數(shù)值均大于對照組，且極小值均高于對照組，提示添加外源寡糖可以延遲瘤胃液真菌數(shù)量到達峰值的時間，從而使較高濃度真菌作用于瘤胃內(nèi)容物的時間增加，且到達峰值的極小值大于對照組的極小值。除MOS組外各試驗組二次項系數(shù)均大于對照組，即二次曲線的開口較對照組小。

表9 瘤胃液真菌數(shù)量與時間的回歸分析Table 9 The regression analysis of number of rumen liquid fungi and time

3 討論

3.1 不同外源寡糖對瘤胃液細菌總數(shù)的影響

本試驗條件下，瘤胃液單位體積內(nèi)細菌總數(shù)分布于8.82×109～10.25×109CFU/mL 之間，屬正常范圍(109～1010CFU/mL)［12］，飼糧添加外源寡糖有提高奶山羊瘤胃液單位體積內(nèi)細菌總數(shù)的趨勢，但未達到顯著性水平。這與張學(xué)峰［14］報道的外源性寡糖對瘤胃液細菌總數(shù)沒有產(chǎn)生顯著性影響的結(jié)果相一致。外源寡糖可以為瘤胃液細菌提供更多可利用的碳水化合物從而促進其增殖，此外，外源寡糖也可以有效改善瘤胃發(fā)酵功能［16］，但不同外源寡糖對瘤胃微生物的增殖效果不同，目前尚無外源寡糖促進瘤胃液細菌增殖機理的定論，有待進一步研究探討。

影響瘤胃液單位體積內(nèi)細菌總數(shù)的因素很多，除飼糧結(jié)構(gòu)外，還有飼喂頻率、飼喂水平、取樣時間以及動物的個體差異等。但總的來說，細菌總數(shù)隨攝入可利用能量的上升而增加。Leedle等［15］報道，在各種飼糧的維持水平條件下瘤胃液細菌總數(shù)是比較穩(wěn)定的，可培養(yǎng)細菌的數(shù)量在飼喂后減少到40% ～60%(2或4 h降到最低)。本試驗結(jié)果顯示瘤胃液單位體積內(nèi)細菌總數(shù)在飼喂后2 h降到最低，飼喂后4 h達到峰值，然后緩慢下降，趨于平衡。原因可能是奶山羊進食后，大量飼料、唾液和飲水進入瘤胃稀釋了原有的瘤胃液，細菌密度下降，即單位體積內(nèi)瘤胃液中所含的細菌總數(shù)降低;由于進食造成奶山羊瘤胃內(nèi)環(huán)境發(fā)生改變，減緩或抑制了細菌在短時間內(nèi)的增殖;進食2～4 h內(nèi)，瘤胃微生物利用進食飼料中的營養(yǎng)物質(zhì)迅速增殖而達到峰值;之后隨著可利用營養(yǎng)物質(zhì)的消耗以及瘤胃內(nèi)環(huán)境包括pH、氧化－還原電位、二氧化碳分壓、溫度等的逐漸穩(wěn)定，瘤胃液細菌濃度又逐漸下降，之后趨于動態(tài)平衡。薛峰［17］報道瘤胃液細菌總數(shù)從飼喂前到飼喂后2 h呈下降趨勢，在2 h到達最低點之后，逐漸上升到飼喂后4 h達最高值。這與本試驗結(jié)果基本一致。

3.2 不同外源寡糖對瘤胃液纖維素分解菌數(shù)量的影響

粗飼料是反芻動物主要的飼料來源，細菌和真菌在分解利用纖維素過程中起主要作用，其中纖維素分解菌扮演重要角色［18］。本試驗結(jié)果表明，不同外源寡糖提高奶山羊瘤胃液單位體積內(nèi)纖維素分解菌數(shù)量的效果不同，其中半乳甘露寡糖和果寡糖達到顯著水平。這與外源寡糖的生理生化功能息息相關(guān)，外源寡糖可以提高營養(yǎng)物質(zhì)瘤胃降解率，還可以通過降低瘤胃液pH、氨態(tài)氮(NH3-N)濃度等改善瘤胃內(nèi)環(huán)境，利于瘤胃纖維素分解菌的生長和增殖。不同外源寡糖對奶山羊瘤胃液單位體積內(nèi)纖維素分解菌數(shù)量影響不同，這與寡糖的結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)和純度等有關(guān)。王新峰等［2］報道果寡糖能夠使黃化瘤胃球菌和產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌的數(shù)量提高，而添加低聚異麥芽糖和混合添加2種寡糖對羔羊瘤胃液細菌總數(shù)和2種纖維降解菌的數(shù)量均有一定的抑制作用，特別是產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌，達到了顯著水平。

3.3 不同外源寡糖對瘤胃液原蟲數(shù)量的影響

大量體內(nèi)體外試驗都表明，原蟲直接參與降解細胞壁多糖的過程［20］。原蟲數(shù)量變化趨勢可以間接反映纖維素的消化情況。本試驗條件下，瘤胃液單位體積內(nèi)原蟲數(shù)量分布于4.65×105～5.08×105CFU/mL 之間，屬正常范圍(105～106CFU/mL)［12］。

原蟲不能利用簡單的含氮化合物合成自身所需要的氨基，其生長必須靠吞噬細菌獲得氨基酸，合成自身蛋白質(zhì)［21］。本試驗條件下，外源寡糖對細菌總數(shù)無顯著性影響，而甘露寡糖顯著提高了奶山羊瘤胃液單位體積內(nèi)原蟲數(shù)量。推測一方面可能是甘露寡糖促進了飼料中蛋白質(zhì)的分解，使得原蟲的蛋白質(zhì)來源增多，從而數(shù)量增多;另一方面可能由于甘露寡糖改善瘤胃內(nèi)環(huán)境利于原蟲增殖的效果優(yōu)于其他外源寡糖。前人研究結(jié)果顯示，甘露寡糖在單胃動物和反芻動物中應(yīng)用效果良好。White等［22］報道，甘露寡糖可以有效抑制大腸桿菌在十二指腸、空腸、盲腸和結(jié)腸的定植，改善斷奶仔豬腸道健康狀況。鮑延安等［23］報道，甘露寡糖可以顯著降低中國荷斯坦奶牛體細胞數(shù)。整個試驗期內(nèi)，瘤胃液單位體積內(nèi)原蟲數(shù)量呈先下降后上升趨勢，這與張學(xué)峰［14］報道的原蟲數(shù)量在晨飼后4 h達到最低點，隨后逐漸升高，在晨飼后12 h達到峰值水平略有差異。原因可能是試驗所用的寡糖種類、飼喂方式及試驗動物等存在差異。

3.4 不同外源寡糖對瘤胃液真菌數(shù)量的影響

瘤胃液厭氧真菌中的絕大部分種屬都能分解纖維素，都具有廣泛的高活性的降解植物細胞壁的纖維素酶、木聚糖酶、果膠酶和酯酶。瘤胃液厭氧真菌的數(shù)量和生物量的估計對于了解厭氧真菌在瘤胃內(nèi)的定量以及在瘤胃內(nèi)的自然變異規(guī)律非常重要。因此本試驗選擇運用滾管法計數(shù)瘤胃液單位體積內(nèi)真菌數(shù)量，作為分析厭氧真菌在瘤胃內(nèi)變化規(guī)律的指標(biāo)。

本試驗條件下，各組真菌數(shù)量分布于4.48×105～6.02×105CFU/mL之間，均在報道的正常真菌數(shù)量范圍(103～ 105CFU/mL)內(nèi)［24－25］，且甘露寡糖和果寡糖顯著提高奶山羊瘤胃液單位體積內(nèi)真菌數(shù)量。分析原因可能是：真菌生長所需的氮源為和氨基酸形式的氮，外源寡糖可以降低瘤胃NH3-N濃度和pH。瘤胃液單位體積內(nèi)真菌數(shù)量與瘤胃內(nèi)環(huán)境息息相關(guān)，當(dāng)瘤胃處于真菌生長的最佳狀態(tài)時，其增殖速度加快，數(shù)量則相應(yīng)增加。戈婷婷等［3］報道飼糧中添加甘露寡糖可以顯著提高培養(yǎng)液中(微生物蛋白)MCP含量、增加瘤胃產(chǎn)氣量、降低NH3-N濃度。凌寶明等［16］報道灌注果寡糖可以降低生長綿羊的瘤胃液pH、NH3-N濃度，提高揮發(fā)性脂肪酸(VFA)含量和瘤胃液MCP濃度。

本試驗條件下，瘤胃液厭氧真菌數(shù)量自晨飼起開始上升，到飼喂后4 h達到峰值，這與原蟲的存在及外源寡糖的添加存在必然聯(lián)系。表6顯示，添加外源寡糖可以提高瘤胃液單位體積內(nèi)原蟲數(shù)量。瘤胃液中原蟲的存在能夠增加飼料在瘤胃中的滯留時間，并且能夠穩(wěn)定瘤胃環(huán)境，這有益于厭氧真菌的形成［26］，但其機理有待進一步探討。

4 結(jié)論

①飼糧添加外源寡糖有提高奶山羊瘤胃液單位體積內(nèi)細菌總數(shù)的趨勢，但無顯著性影響。

②半乳甘露寡糖和果寡糖可以顯著提高奶山羊瘤胃液纖維素分解菌數(shù)量。

③甘露寡糖可以顯著提高奶山羊瘤胃液原蟲數(shù)量。

④甘露寡糖和果寡糖可以顯著提高奶山羊瘤胃液真菌數(shù)量。

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