高壓氧治療對顱腦損傷大鼠谷胱甘肽過氧化物酶及丙二醛的影響

張 良 楊 晨 潘樹義 張 禹

海軍總醫(yī)院全軍高壓氧中心，北京 100048

創(chuàng)傷性顱腦損傷（traumatic brain injury，TBI）是臨床常見病、多發(fā)病，由于病情危重、變化急驟，其總體死亡率和致殘率一直居高不下，嚴重威脅人們生命安全，且TBI治療耗費大量的醫(yī)療資源，增加社會負擔，所以探求有效治療TBI的方法具有重要的臨床意義。

傳統(tǒng)治療TBI的方法是早期實施外科手術(shù)，同時結(jié)合藥物、亞低溫手段。隨著神經(jīng)外科技術(shù)的發(fā)展和重癥醫(yī)療救護能力的提高，絕大多數(shù)患者都能得到及時救治，特別是早期實施開顱減壓能減輕腦水腫對正常腦組織進一步損害，挽救患者的生命。但后期TBI患者神經(jīng)功能的缺失卻一直是無法解決的問題，患者無法生活自理，甚至一些患者呈永久植物狀態(tài)生存。經(jīng)多中心臨床研究表明，藥物及亞低溫治療對重型TBI患者功能恢復并無太多益處[1-4]。而高壓氧（hyperbaric oxygen，HBO）作為一種新生的治療手段，經(jīng)研究證實，不僅可以在早期起到降低顱內(nèi)壓[5-7]、減輕腦水腫[8]的“內(nèi)科減壓”治療作用，同時在細胞及亞細胞水平上阻斷腦水腫病理過程的進一步發(fā)展，防止二次損傷[9-11]，對后期神經(jīng)功能改善起到積極的治療作用[12-13]，但HBO是否增加氧化損傷一直存在爭論。

本實驗通過比較腦損傷組、HBO治療組及空白對照組大鼠腦血清谷胱甘肽過氧化物酶 （glutathione peroxidase，GSH-Px）活力、丙二醛（maleic dialdehyde，MDA）含量的差別，尋找TBI模型大鼠氧化-抗氧化指標在HBO治療干預下的變化規(guī)律，為臨床HBO治療TBI患者提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與材料

液壓撞擊儀系統(tǒng) （HPD-1700，31.28 mV/psi， 美國Dragenfly有限公司生產(chǎn)），電子天平（YP1200，上海第二天平儀器廠生產(chǎn)），電動牙科打磨機（90型，佛山市安友伴醫(yī)療器械有限公司生產(chǎn)），電動離心機（KA100，上海安亭科學儀器廠生產(chǎn)），單人純氧艙（NG90-ⅢBd單人醫(yī)用高壓氧艙，寧波高壓氧艙總廠生產(chǎn)），分光光度計（ultrospec 3000 pro分光光度計，由海軍總醫(yī)院中心實驗室提供）。GSH-Px活力、MDA含量測定試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。

1.2 實驗分組及HBO治療方案

雄性Wistar大鼠80只隨機分為8組，每組10只，其中1～4組為腦損傷組，分別于建模后24 h內(nèi)、第5天、第10天、第15天處死；5～7組為HBO治療組，5組建模當天開始行HBO治療至第5天處死，6組建模后第5天開始行HBO治療至第10天處死，7組建模后第10天開始行HBO治療至第15天處死；8組為空白對照組。按損傷后階段劃分，2組（腦損傷組）與5組（HBO治療組）、3組與6組、4組與7組相對應。腦損傷組與HBO治療組大鼠都進行液壓撞擊建立模型，治療組大鼠行HBO治療，治療壓力2.0 ATA，氧氣洗艙時間5 min，加壓時間 5 min，減壓時間 5 min，穩(wěn)壓吸氧 45 min，艙內(nèi)溫度（23.3±2）℃。 1次/d，共 5次。

1.3 TBI模型的建立

采用側(cè)位液壓撞擊（lateral fluid percussion，LFP）法建立TBI大鼠模型[14-15]，清潔級雄性Wistar大鼠（中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院實驗動物中心提供，批號：SCXK-（軍）2007-004，共 80 只，體重（276±26）g。 大鼠術(shù)前均禁食 12h，禁水 6 h[16]，稱重后以10%水合氯醛（按3.5 g/kg麻醉劑量）[17]腹腔內(nèi)注射麻醉后，俯臥位于固定板上固定，去除大鼠頭部正中線處毛發(fā)暴露皮膚，安爾碘常規(guī)消毒。沿正中線由顱底部向鼻部剪開頭皮，鈍性分離頭皮下筋膜直至右側(cè)冠狀縫至人字縫之間顱骨完全暴露。使用電動牙科打磨機于矢狀縫右側(cè)4 mm、冠狀縫后側(cè)4 mm交點處鉆孔，鉆孔直徑約4 mm，穿透顱骨，硬腦膜完整[18]。以37℃生理鹽水注入撞擊儀儲液裝置內(nèi)，連接大鼠露骨鉆孔處，按電壓-力量換算公式計算打擊力度的電壓值[19-20]，使用相同重錘下落高度，液壓撞擊儀撞擊1次，經(jīng)示波器讀取電壓值，換算為打擊力度。撞擊結(jié)束后安爾碘常規(guī)消毒切開皮膚，縫合頭皮。

根據(jù)文獻選擇打擊力度，通過調(diào)節(jié)重錘下落距離調(diào)整打擊力量，調(diào)節(jié)至示波器顯示（1.24±0.023）v[（273.27±5.07）kPa，中～重度損傷][20]。

1.4 指標測定

GSH-Px活力測定采用比色法，MDA含量測定采用硫代巴比妥酸法。

1.5 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析，計量資料統(tǒng)計學描述采用均數(shù)±標準差（x±s）。表示。多組間比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 各組總體GSH-Px活力、MDA含量比較

結(jié)果顯示，GSH-Px活力損傷組顯著低于空白對照組（P＜0.01），治療組顯著高于損傷組（P＜0.01）；MDA含量損傷組顯著高于空白對照組（P＜0.01）。見表1。

表1 各組總體GSH-Px活力、MDA含量比較（x±s）

2.2 各組不同階段GSH-Px活力、MDA含量比較

GSH-Px活力不同階段治療組均高于相應時期損傷組，其中6組 （建模后第5天開始行HBO治療至第10天處死）顯著高于3組（建模后第10天處死）（P＜0.01），損傷組1至4組呈時間相關(guān)性升高；MDA含量損傷組1至4組呈時間相關(guān)性下降，其中1、2組均顯著高于空白對照組（P＜0.01）。見表2。

表2 不同階段腦損傷組、HBO治療組與空白對照組GSH-Px活力、MDA 含量比較（x±s，n=10）

3 討論

TBI發(fā)生后，損傷局部腦血流量減低、氧彌散功能障礙導致?lián)p傷局部腦組織缺血缺氧，有氧代謝減少、無氧代謝增加，結(jié)果是酸性產(chǎn)物增多、細胞能量消耗增加。能量供給不足，細胞膜轉(zhuǎn)運功能失調(diào)，發(fā)生細胞內(nèi)鈣離子超載等細胞內(nèi)水、電解質(zhì)紊亂。異常的細胞內(nèi)環(huán)境導致興奮性氨基酸及大量自由基釋放。大量自由基釋放作用于生物體膜結(jié)構(gòu)，導致細胞膜及亞細胞膜（如線粒體）結(jié)構(gòu)及功能損害，進而引發(fā)以脂質(zhì)過氧化反應（lipid peroxidation，LP）為主要機制的病理生理變化過程[4]。所以，TBI發(fā)生后機體發(fā)生氧化應激（oxidative stress，OS）損傷是一個必然的病理過程，其實質(zhì)是氧化-抗氧化不平衡[21]，即活性氧過量生成和/或抗氧化防御系統(tǒng)受損，導致超氧陰離子（O2）、過氧化氫（H2O2）等氧自由基及其相關(guān)代謝產(chǎn)物過量聚集，而對細胞產(chǎn)生多種毒性作用。在這個過程中，GSH-Px作為清除自由基主要組成部分，反映機體的抗氧化能力；MDA為膜結(jié)構(gòu)發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應的代謝產(chǎn)物，間接反映氧化損傷的程度。

HBO作為TBI治療的一種重要手段已得到一致認可，它可以改善損傷后局部組織缺氧、減輕水腫，而目前HBO治療是否增加氧化損傷仍存在爭議。本實驗中，腦損傷組與空白對照組比較，GSH-Px活力顯著降低（P＜0.01），MDA含量顯著升高（P＜0.01），說明TBI模型大鼠損傷后存在明顯的氧化-抗氧化失衡，氧化損傷明顯。同時，腦損傷組GSH-Px呈時間相關(guān)性升高，且均低于空白對照組；MDA含量呈現(xiàn)時間相關(guān)性降低，直至第15天仍高于空白對照組，說明TBI模型大鼠氧化應激在1～2 d達到高峰后，機體自身的抗氧化能力緩慢提高，但仍處于氧化-抗氧化失衡狀態(tài)。

本實驗還發(fā)現(xiàn)HBO治療組與腦損傷組比較，GSH-Px活性顯著升高（P＜0.01），提示HBO治療使模型大鼠抗氧化能力明顯增強，氧化-抗氧化平衡明顯向?qū)筄S的方向發(fā)展，氧化損傷有減輕的趨勢。而在這個過程中，筆者觀察到6組（損傷第5天開始行HBO治療）GSH-Px活力最高，甚至高于空白對照組，MDA含量除空白對照組外最低，且6組與3組（時間相對應損傷組）比較，GSH-Px活力顯著升高 （P＜0.01），MDA 含量降低（P=0.066）。同時，7 組（損傷后 10 天開始行HBO治療）GSH-Px活力低于6組，MDA含量與6組相同，提示在TBI模型大鼠損傷后早期特定時間段內(nèi)（第5天）給予HBO治療，能夠極大的提高抗氧化能力，使氧化-抗氧化平衡短時間內(nèi)迅速向抗氧化能力提高方向發(fā)展，最大程度的減少氧化損傷，而如果在上述特定的時間之前給予HBO治療，對于提高模型大鼠抗氧化能力的作用減弱，甚至有可能使氧化-抗氧化平衡向氧化損傷加重的方向發(fā)展，提示臨床HBO治療有治療時間窗問題，即在TBI極早期氧化應激尚處于最明顯階段給予HBO治療并不是最佳時機，而在機體抗氧化能力逐漸提高的特定時期給予HBO治療，能夠獲得很好的提高抗氧化能力、減輕氧化損傷的效果。

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