AngⅡ促進(jìn)大鼠血管平滑肌細(xì)胞增殖和遷移

劉 玉，王海軍，溫進(jìn)坤，李愛英，李菁菁，韓 梅*

（河北醫(yī)科大學(xué)1.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所生物化學(xué)與分子生物學(xué)研究室河北省醫(yī)學(xué)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北石家莊 050017;2.中醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，河北石家莊 050091;3.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院細(xì)胞生物學(xué)教研室，河北石家莊 050017;4.河北大學(xué)附屬醫(yī)院普通外科，河北保定 071000）

AngⅡ促進(jìn)大鼠血管平滑肌細(xì)胞增殖和遷移

劉 玉1，2，王海軍4，溫進(jìn)坤1，李愛英2，李菁菁3，韓 梅1*

（河北醫(yī)科大學(xué)1.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所生物化學(xué)與分子生物學(xué)研究室河北省醫(yī)學(xué)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北石家莊 050017;2.中醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，河北石家莊 050091;3.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院細(xì)胞生物學(xué)教研室，河北石家莊 050017;4.河北大學(xué)附屬醫(yī)院普通外科，河北保定 071000）

血管平滑肌細(xì)胞（vascular smooth muscle cells，VSMCs）的增殖、遷移和細(xì)胞外基質(zhì)的合成是高血壓、動脈粥樣硬化和血管成形術(shù)后再狹窄等血管重塑性疾病發(fā)生、發(fā)展的重要細(xì)胞病理學(xué)基礎(chǔ)［1］。血管緊張素Ⅱ（angiotensinⅡ，AngⅡ）的促生長作用參與了高血壓、動脈粥樣硬化、血管再狹窄等血管增殖性疾病的發(fā)生和發(fā)展。本實(shí)驗(yàn)觀察AngⅡ?qū)SMCs細(xì)胞增殖及遷移的影響，進(jìn)一步闡明血管增殖性疾病的發(fā)病機(jī)理，為臨床防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)與試劑:80～100 g健康雄性SD大鼠，取胸腹主動脈血管中膜用貼塊法分離、培養(yǎng)VSMCs［2］。取3～6代細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。待細(xì)胞生長至70%～80%匯合后換用無血清培養(yǎng)液饑餓培養(yǎng)16 h，使細(xì)胞處于靜止期，然后換用含2%FBS 的 培 養(yǎng) 液，分 別 加 入 不 同 濃 度 （10－8、10－7和10－6mol/L）的 AngⅡ（Sigma公司）孵育24 h，或10－7mol/L的AngⅡ孵育不同時(shí)間 （3、6、12、24和48 h），收集細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.2 細(xì)胞增殖活力分析:利用細(xì)胞計(jì)數(shù)方法進(jìn)行細(xì)胞增殖活性分析［3］。

1.3 傷口愈合實(shí)驗(yàn):將VSMCs接種于玻片上，于低倍鏡下觀察細(xì)胞傷口愈合情況。任意取3個(gè)視野，計(jì)數(shù)遷移細(xì)胞的數(shù)量，以此表示細(xì)胞的遷移活性。

1.4 總RNA提取及RT-PCR:按照Invitrogen公司的產(chǎn)品手冊，采用 Trizol一步法，從不同處理組的 VSMCs中提取總RNA。經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定RNA完整性，紫外分光光度計(jì)檢測RNA的純度和濃度。按照Promega公司M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶試劑盒說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。繼之，建立PCR反應(yīng)體系，置PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳分離，掃描成像，用凝膠成像分析系統(tǒng)進(jìn)行密度分析。以β-actin作為內(nèi)參照。

2 結(jié)果

2.1 AngⅡ?qū)SMCs增殖和遷移的影響:隨著AngⅡ濃度增加，VSMCs增殖和遷移不斷升高（圖1）。其中，AngⅡ濃度為10－7mol/L時(shí)細(xì)胞增殖和遷移明顯升高（圖1A，C），在此基礎(chǔ)上，選取10－7mol/L AngⅡ處理細(xì)胞，隨著刺激時(shí)間的延長，VSMCs增殖和遷移逐漸升高（圖1B，D）。具有明顯的量-效和時(shí)-效關(guān)系。

2.2 AngⅡ?qū)SMCsSM22α和PCNAmRNA表達(dá)的影響:隨著AngⅡ濃度增加，SM22α mRNA表達(dá)逐漸降低，在10－7mol/L時(shí)明顯降低（P＜0.01），隨著AngⅡ刺激時(shí)間延長，SM22α表達(dá)逐漸降低，在12 h時(shí)降低較為顯著（P＜0.01）（圖 2）。與SM22α的表達(dá)變化相反，PCNA表達(dá)在10－7mol/L時(shí)明顯增高（P＜0.01）（圖2A）。PCNA表達(dá)在24 h明顯升高（P＜0.01）（圖2B）。

3 討論

VSMCs的增殖和遷移是導(dǎo)致許多心血管疾病的重要的病理學(xué)基礎(chǔ)。生理?xiàng)l件下VSMCs存在著有序的增殖與凋亡，二者保持平衡。在許多病理情況下，外界環(huán)境造成某些生長因子增多，繼而通過刺激信號轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)，促進(jìn)某些基因表達(dá)增多，從而使VSMCs的增殖失控，導(dǎo)致血管壁一系列的病理改變。因此，抑制VSMCs的增殖是有效治療動脈粥樣硬化、高血壓與血管再狹窄等心血管疾病的重要措施之一。

本研究發(fā)現(xiàn)，AngⅡ刺激可誘導(dǎo)VSMCs發(fā)生表型轉(zhuǎn)化，以濃度和時(shí)間依賴的方式促進(jìn)VSMCs增殖。傷口愈合實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，AngⅡ同樣以濃度和時(shí)間依賴的方式促進(jìn)VSMCs的遷移活性，促進(jìn)其向血管內(nèi)膜下遷移。

本研究采用RT-PCR方法，在轉(zhuǎn)錄水平證實(shí)，AngⅡ可抑制VSMCs分化標(biāo)志基因SM22α的表達(dá)，同時(shí)促進(jìn)增殖標(biāo)志基因PCNA的表達(dá)，并且具有明顯的濃度和時(shí)間依賴效應(yīng)。

以上結(jié)果表明，AngⅡ可以通過影響VSMCs分化標(biāo)志基因SM22α和增殖標(biāo)志基因PCNA的表達(dá)而促進(jìn)VSMCs增殖和遷移。本研究為揭示VSMCs增殖的發(fā)生機(jī)制，防治血管重塑和逆轉(zhuǎn)增殖性血管病變具有重要的意義。

［1］Li HX，Han M，Michel B，et al.Krüppel-like factor 4 promotes differentiation by transforming growth factor-β receptor-mediated smad and P38 MAPK signaling in vascular smooth muscle cells［J］.J Biol Chem，2010，285:17846－17856.

［2］Han M，Wen JK，Zheng B，et al.Serum deprivation results in redifferentiation of human umbilical vascular smooth muscle cells［J］.Am J Physiol Cell Physiol，2006，291:C50－C58.

［3］Bishop-Bailey D，Hla T，Warner TD.Intimal smooth muscle cells as a target for peroxisome proliferator-activated receptor-gamma ligand therapy［J］.Circ Res，2002，91:210－217.

R 3

A

1001-6325（2012）01-0089-03

2010－11－02

2011－05－30

國家自然科學(xué)基金（31071003）;國家自然科學(xué)基金（青年基金）（30700405）*< class="emphasis_bold">通信作者（corresponding author）:

（corresponding author）:hanmei@hebmu.edu.cn

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