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    AngⅡ促進(jìn)大鼠血管平滑肌細(xì)胞增殖和遷移

    2012-06-05 05:10:42王海軍溫進(jìn)坤李愛英李菁菁
    關(guān)鍵詞:分子生物學(xué)教研室生物化學(xué)

    劉 玉,王海軍,溫進(jìn)坤,李愛英,李菁菁,韓 梅*

    (河北醫(yī)科大學(xué)1.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所生物化學(xué)與分子生物學(xué)研究室河北省醫(yī)學(xué)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,河北石家莊 050017;2.中醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室,河北石家莊 050091;3.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院細(xì)胞生物學(xué)教研室,河北石家莊 050017;4.河北大學(xué)附屬醫(yī)院普通外科,河北保定 071000)

    AngⅡ促進(jìn)大鼠血管平滑肌細(xì)胞增殖和遷移

    劉 玉1,2,王海軍4,溫進(jìn)坤1,李愛英2,李菁菁3,韓 梅1*

    (河北醫(yī)科大學(xué)1.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所生物化學(xué)與分子生物學(xué)研究室河北省醫(yī)學(xué)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,河北石家莊 050017;2.中醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室,河北石家莊 050091;3.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院細(xì)胞生物學(xué)教研室,河北石家莊 050017;4.河北大學(xué)附屬醫(yī)院普通外科,河北保定 071000)

    血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs)的增殖、遷移和細(xì)胞外基質(zhì)的合成是高血壓、動脈粥樣硬化和血管成形術(shù)后再狹窄等血管重塑性疾病發(fā)生、發(fā)展的重要細(xì)胞病理學(xué)基礎(chǔ)[1]。血管緊張素Ⅱ(angiotensinⅡ,AngⅡ)的促生長作用參與了高血壓、動脈粥樣硬化、血管再狹窄等血管增殖性疾病的發(fā)生和發(fā)展。本實(shí)驗(yàn)觀察AngⅡ?qū)SMCs細(xì)胞增殖及遷移的影響,進(jìn)一步闡明血管增殖性疾病的發(fā)病機(jī)理,為臨床防治提供理論依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 細(xì)胞培養(yǎng)與試劑:80~100 g健康雄性SD大鼠,取胸腹主動脈血管中膜用貼塊法分離、培養(yǎng)VSMCs[2]。取3~6代細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。待細(xì)胞生長至70%~80%匯合后換用無血清培養(yǎng)液饑餓培養(yǎng)16 h,使細(xì)胞處于靜止期,然后換用含2%FBS 的 培 養(yǎng) 液,分 別 加 入 不 同 濃 度 (10-8、10-7和10-6mol/L)的 AngⅡ(Sigma公司)孵育24 h,或10-7mol/L的AngⅡ孵育不同時(shí)間 (3、6、12、24和48 h),收集細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

    1.2 細(xì)胞增殖活力分析:利用細(xì)胞計(jì)數(shù)方法進(jìn)行細(xì)胞增殖活性分析[3]。

    1.3 傷口愈合實(shí)驗(yàn):將VSMCs接種于玻片上,于低倍鏡下觀察細(xì)胞傷口愈合情況。任意取3個(gè)視野,計(jì)數(shù)遷移細(xì)胞的數(shù)量,以此表示細(xì)胞的遷移活性。

    1.4 總RNA提取及RT-PCR:按照Invitrogen公司的產(chǎn)品手冊,采用 Trizol一步法,從不同處理組的 VSMCs中提取總RNA。經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定RNA完整性,紫外分光光度計(jì)檢測RNA的純度和濃度。按照Promega公司M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶試劑盒說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。繼之,建立PCR反應(yīng)體系,置PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳分離,掃描成像,用凝膠成像分析系統(tǒng)進(jìn)行密度分析。以β-actin作為內(nèi)參照。

    2 結(jié)果

    2.1 AngⅡ?qū)SMCs增殖和遷移的影響:隨著AngⅡ濃度增加,VSMCs增殖和遷移不斷升高(圖1)。其中,AngⅡ濃度為10-7mol/L時(shí)細(xì)胞增殖和遷移明顯升高(圖1A,C),在此基礎(chǔ)上,選取10-7mol/L AngⅡ處理細(xì)胞,隨著刺激時(shí)間的延長,VSMCs增殖和遷移逐漸升高(圖1B,D)。具有明顯的量-效和時(shí)-效關(guān)系。

    2.2 AngⅡ?qū)SMCsSM22α和PCNAmRNA表達(dá)的影響:隨著AngⅡ濃度增加,SM22α mRNA表達(dá)逐漸降低,在10-7mol/L時(shí)明顯降低(P<0.01),隨著AngⅡ刺激時(shí)間延長,SM22α表達(dá)逐漸降低,在12 h時(shí)降低較為顯著(P<0.01)(圖 2)。與SM22α的表達(dá)變化相反,PCNA表達(dá)在10-7mol/L時(shí)明顯增高(P<0.01)(圖2A)。PCNA表達(dá)在24 h明顯升高(P<0.01)(圖2B)。

    3 討論

    VSMCs的增殖和遷移是導(dǎo)致許多心血管疾病的重要的病理學(xué)基礎(chǔ)。生理?xiàng)l件下VSMCs存在著有序的增殖與凋亡,二者保持平衡。在許多病理情況下,外界環(huán)境造成某些生長因子增多,繼而通過刺激信號轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò),促進(jìn)某些基因表達(dá)增多,從而使VSMCs的增殖失控,導(dǎo)致血管壁一系列的病理改變。因此,抑制VSMCs的增殖是有效治療動脈粥樣硬化、高血壓與血管再狹窄等心血管疾病的重要措施之一。

    本研究發(fā)現(xiàn),AngⅡ刺激可誘導(dǎo)VSMCs發(fā)生表型轉(zhuǎn)化,以濃度和時(shí)間依賴的方式促進(jìn)VSMCs增殖。傷口愈合實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,AngⅡ同樣以濃度和時(shí)間依賴的方式促進(jìn)VSMCs的遷移活性,促進(jìn)其向血管內(nèi)膜下遷移。

    本研究采用RT-PCR方法,在轉(zhuǎn)錄水平證實(shí),AngⅡ可抑制VSMCs分化標(biāo)志基因SM22α的表達(dá),同時(shí)促進(jìn)增殖標(biāo)志基因PCNA的表達(dá),并且具有明顯的濃度和時(shí)間依賴效應(yīng)。

    以上結(jié)果表明,AngⅡ可以通過影響VSMCs分化標(biāo)志基因SM22α和增殖標(biāo)志基因PCNA的表達(dá)而促進(jìn)VSMCs增殖和遷移。本研究為揭示VSMCs增殖的發(fā)生機(jī)制,防治血管重塑和逆轉(zhuǎn)增殖性血管病變具有重要的意義。

    [1]Li HX,Han M,Michel B,et al.Krüppel-like factor 4 promotes differentiation by transforming growth factor-β receptor-mediated smad and P38 MAPK signaling in vascular smooth muscle cells[J].J Biol Chem,2010,285:17846-17856.

    [2]Han M,Wen JK,Zheng B,et al.Serum deprivation results in redifferentiation of human umbilical vascular smooth muscle cells[J].Am J Physiol Cell Physiol,2006,291:C50-C58.

    [3]Bishop-Bailey D,Hla T,Warner TD.Intimal smooth muscle cells as a target for peroxisome proliferator-activated receptor-gamma ligand therapy[J].Circ Res,2002,91:210-217.

    R 3

    A

    1001-6325(2012)01-0089-03

    2010-11-02

    2011-05-30

    國家自然科學(xué)基金(31071003);國家自然科學(xué)基金(青年基金)(30700405)*< class="emphasis_bold">通信作者(corresponding author):

    (corresponding author):hanmei@hebmu.edu.cn

    book=91,ebook=144

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