KiSS-1及VEGF在肝細(xì)胞癌組織中的表達(dá)及臨床意義

潘夢(mèng)音，趙建龍，袁 帥，李世朋，賈巖巖，曹鵬濤，周 潔，馮凱祥

KiSS-1及VEGF在肝細(xì)胞癌組織中的表達(dá)及臨床意義

潘夢(mèng)音，趙建龍，袁 帥，李世朋，賈巖巖，曹鵬濤，周 潔，馮凱祥

目的探討KiSS-1蛋白和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）在肝細(xì)胞癌中的表達(dá)及臨床意義。方法 采用免疫組化法檢測(cè)33例HCC組織，25例癌旁組織和20例正常肝組織中KiSS-1蛋白和VEGF蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果HCC組織中的KiSS-1蛋白和VEGF的陽(yáng)性表達(dá)率分別為27.27%（9／33）、81.82%（27／33）；在癌旁組織及正常肝組織中則分別為的72.00%（18／25）、52.00%（9／25）和85.00%（17／20）、45.00%（9／20），差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；肝細(xì)胞癌中KiSS-1蛋白和VEGF的表達(dá)均與腫瘤分化程度、臨床分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有密切聯(lián)系，二者在HCC中的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（r＝－0.770，P＜0.05）。結(jié)論KiSS-1蛋白在肝細(xì)胞癌中的表達(dá)明顯下調(diào)，VEGF蛋白在肝細(xì)胞癌中的表達(dá)增多，二者表達(dá)呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)性，可能參與促進(jìn)了腫瘤的發(fā)生、侵襲和轉(zhuǎn)移。

肝細(xì)胞癌；KiSS-1蛋白；VEGF；免疫組化；侵襲；轉(zhuǎn)移

肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）占原發(fā)性肝癌90%以上［1］，目前其治療手段仍以外科手術(shù)為主，但效果欠佳。因此，加強(qiáng)對(duì)HCC發(fā)展轉(zhuǎn)移分子機(jī)制的研究尤為重要。KiSS-1基因是在人類黑色素細(xì)胞株中發(fā)現(xiàn)、分離并克隆出的一個(gè)新的腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因［2］，能顯著抑制腫瘤細(xì)胞浸潤(rùn)侵襲。HCC的生長(zhǎng)、浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移均依賴于血管的病理性增生，而血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子VEGF在此過(guò)程中扮演著重要角色。本文采用免疫組化法對(duì)KiSS-1蛋白和VEGF在HCC中的的表達(dá)情況進(jìn)行觀察，并探討KiSS-1蛋白和VEGF與HCC擴(kuò)散、侵襲和預(yù)后的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象收集解放軍150中心醫(yī)院2006年6月～2011年8月接受肝細(xì)胞癌手術(shù)治療患者術(shù)后存檔的33例HCC患者病理蠟塊標(biāo)本，所有患者術(shù)前均未行放化療，病例臨床資料完整。另取癌旁組織25例和正常組織20例作為實(shí)驗(yàn)對(duì)照。

1.2 主要試劑與設(shè)備KiSS-1兔抗人抗體（稀釋濃度1∶100），VEGF兔抗人抗體（稀釋濃度1∶150）、SP －0023免疫組化試劑盒（美國(guó)ZYMED公司產(chǎn)品）均購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；DAB顯色試劑盒（AR－0612）購(gòu)自北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限公司。其他試劑均為分析純。

1.3 方法采用免疫組織化學(xué)法SABC常規(guī)石蠟包埋組織切片，脫臘水化，DDW、PBS沖洗，抗原修復(fù)維持15 m in后冷卻至室溫，PBS沖洗2 m in×3次，加去離子水室溫下孵育10 min，PBS沖洗2 min ×3次，每張切片滴加抗山羊血清室溫下孵育。滴加一抗4℃冰箱過(guò)夜，PBS沖洗2 min×3次。滴加生物素標(biāo)記二抗室溫孵育30 m in，PBS沖洗5 m in×3次，DAB顯色，顯微鏡下控制反應(yīng)。蒸餾水漂洗，蘇木精復(fù)染，鹽酸酒精分化，脫水，中性樹(shù)膠封片。

1.4 染色結(jié)果判定選用試劑盒中的陽(yáng)性片作為陽(yáng)性對(duì)照，PBS取代一抗作為陰性對(duì)照。KiSS-1蛋白，VEGF可以表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)和（或）細(xì)胞膜，染色呈棕黃色視為陽(yáng)性。每張切片隨機(jī)選擇5個(gè)高倍視野，每個(gè)高倍鏡視野（×200）計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞，采用半定量積分法依據(jù)染色強(qiáng)度和陽(yáng)性細(xì)胞百分率判斷染色結(jié)果［3］。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。樣本率的比較采用χ2檢驗(yàn)，相關(guān)性分析采用Spearman相關(guān)檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 KiSS-1蛋白的表達(dá)KiSS-1蛋白在HCC組織中呈弱陽(yáng)性表達(dá)，表達(dá)率為27.27%（9／33），較之于癌旁組織的72.00%（18／25）和正常肝組織的85.00%（17／20），呈現(xiàn)明顯的降低和缺失，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

2.2 VEGF的表達(dá)在HCC中VEGF高表達(dá)，細(xì)胞胞膜和胞質(zhì)中可見(jiàn)大量棕黃色染色，陽(yáng)性表達(dá)率為81.82%（27／33），明顯高于癌旁組織和正常組織中VEGF陽(yáng)性表達(dá)率52.00%（13／25）和45.00% （9／20），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

2.3 KiSS-1蛋白、VEGF的表達(dá)與HCC臨床病理參數(shù)的關(guān)系KiSS-1蛋白、VEGF的表達(dá)均與HCC組織分型、臨床分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。肝細(xì)胞癌組織中，低未分化、Ⅲ～Ⅳ期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽(yáng)性者KiSS-1蛋白的表達(dá)明顯低于高中分化、I～Ⅱ期和無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者（P＜0.05）；而VEGF在低未分化、Ⅲ～Ⅳ期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽(yáng)性的HCC組織中的表達(dá)顯著高于其在高中分化、I～Ⅱ期和無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移HCC組織中的表達(dá)（P＜0.05），見(jiàn)表1。

2.4 KiSS-1蛋白與VEGF的表達(dá)關(guān)系33例HCC組織中，KiSS-1蛋白表達(dá)陽(yáng)性，VEGF表達(dá)陰性的組織有6例；KiSS-1陰性，VEGF陽(yáng)性的組織有24例。采用Spearman相關(guān)檢驗(yàn)計(jì)算相關(guān)系數(shù)，表明兩種蛋白在肝細(xì)胞癌中的表達(dá)存在負(fù)相關(guān)性（r＝－0.770，P＜0.05）。二者在HCC中表達(dá)呈負(fù)相關(guān)趨勢(shì)，見(jiàn)表2。

表1 肝細(xì)胞癌中KiSS-1蛋白和VEGF表達(dá)與臨床病理學(xué)參數(shù)的關(guān)系

表2 KiSS-1蛋白和VEGF在肝細(xì)胞癌中表達(dá)的相互關(guān)系

3 討論

腫瘤轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致肝癌患者高死亡率的主要原因之一，因此能否控制腫瘤轉(zhuǎn)移直接影響到惡性腫瘤患者的治療及預(yù)后。相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究表明［4］，腫瘤轉(zhuǎn)移是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，往往涉及多個(gè)癌基因和抑癌基因的改變，癌基因的活化與抑癌基因抑制功能之間的失衡是導(dǎo)致其發(fā)生的基礎(chǔ)。KiSS-1是在人類黑色素細(xì)胞株中發(fā)現(xiàn)的一種新腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因，定位于1號(hào)染色體長(zhǎng)臂區(qū)lq32～q41區(qū)［5］包含4個(gè)外顯子，其編碼的由145個(gè)氨基酸組成的親水性蛋白［6］能夠抑制腫瘤細(xì)胞浸潤(rùn)侵襲，限制腫瘤細(xì)胞遷移能力［7］。實(shí)驗(yàn)研究表明乳腺癌、胰腺癌等癌組織中KiSS-1的表達(dá)明顯低于癌旁組織［8－9］。本研究結(jié)果顯示肝細(xì)胞癌組織中KiSS-1蛋白表達(dá)與癌旁組織和正常肝臟組織相比明顯減少，以上差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；隨著肝細(xì)胞癌腫瘤分化程度的升高KiSS-1蛋白陽(yáng)性表達(dá)率升高（P＜0.05）；Ⅲ～Ⅳ期肝癌組織中KiSS-1蛋白的表達(dá)水平分別比I～Ⅱ期低（P＜0.05）；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移肝癌中的陽(yáng)性率明顯低于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者（P＜0.05）。提示KiSS-1蛋白的缺失與HCC的發(fā)生、臨床侵襲及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，是一個(gè)癌抑制基因。

為了保持自身無(wú)限制侵襲性生長(zhǎng)，腫瘤組織必須依賴持續(xù)廣泛的新生血管形成［10］。肝細(xì)胞癌是多血管惡性腫瘤，其生長(zhǎng)、浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移均依賴于血管。VEGF是近年來(lái)備受人們關(guān)注并被公認(rèn)為人體內(nèi)最強(qiáng)的一種血管生成促進(jìn)因子，具有多種受體。Yoshiji H等［11］曾用VEGFR-1和VEGFR-2的單克隆抗體R-1mAb和R-2mAb對(duì)VEGFR-1和VEGFR-2分別進(jìn)行中和，發(fā)現(xiàn)兩者都能顯著地通過(guò)抑制腫瘤新生血管生成的方式達(dá)到抑制一些相關(guān)腫瘤生長(zhǎng)；兩種抗體聯(lián)合則幾乎可以達(dá)到完全阻斷腫瘤發(fā)展和血管生成的目的。本研究中發(fā)現(xiàn)VEGF在肝癌組織中的表達(dá)要遠(yuǎn)高于癌旁組織和正常組織（P＜0.05），另外在肝細(xì)胞癌組織中的表達(dá)與組織分型、臨床分期和有無(wú)淋巴結(jié)有關(guān)（P＜0.05），表明VEGF在肝癌的發(fā)生發(fā)展和血管生成的過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。

本研究在對(duì)KiSS-1蛋白和VEGF陽(yáng)性表達(dá)率數(shù)據(jù)的對(duì)比分析中發(fā)現(xiàn)癌組織中二者的表達(dá)呈顯著負(fù)相關(guān)（r＝－0.770，P＜0.05），提示KiSS-1和VEGF與肝細(xì)胞腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移有關(guān)，同時(shí)檢測(cè)KiSS-1、VEGF蛋白的表達(dá)有助于綜合評(píng)估HCC的生物學(xué)行為，并為肝癌機(jī)制及可行治療措施的探索研究提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)及理論依據(jù)。

［1］Park in DM，Bray F，F(xiàn)erlay J，etal.Global cancer statistics2002 ［J］.CA Cancer JClin，2005，55（1）：74－108.

［2］Lee JH，Welch DR.Identification of highly expressed gene in metastasis-suppressed chromosome 6／human malignantmelanoma hybrid cells using subtractive hybridization and differential display［J］.Int JCancer，1997，71（6）：1035－1044.

［3］李世朋，王朏朏，丁雪貞，等.AQP-1在腎透明細(xì)胞癌組織中的表達(dá)與臨床意義［J］.腫瘤基礎(chǔ)與臨床，2012，25（1）：6 －8.

［4］Hata K，Dhar DK，Watanabe Y，et al.Expression of metastin and a G-protein-coupled receptor（AXOR12）in epithelial ovarian cancer［J］.Eur JCancer，2007，43（9）：1452－1459.

［5］Yu GZ，Wang JJ，Chen Y，et al.Significance of KiSS-1 and S100A4 in the process of metastasis of gastric carcinoma［J］.The Chinese-German Journal of Clinical Oncology，2006，5（6）：388－390.

［6］West A，Vojta PJWelch DR，et al.Chromosome localization and，genomic structure of the KiSS-1 metastasis suppressor gene （KiSS-1）［J］.Genomics，1998 54（1）：145－148.

［7］Takeda T，Kikuchi E，Mikam i S，et al.Prognostic role of KiSS-1 and possibility of therapeutic modality of metastin，the final peptide of the KiSS-1 gene，in urothelial carcinoma［J］.Mol Cancer Ther，2012，11（4）：853－863.

［8］吳愛(ài)國(guó)，張華霖，陳海金，等.KiSS-1基因在乳腺癌組織中的表達(dá)及臨床意義［J］.實(shí)用腫瘤雜志，2006，21（4）：333 －335.

［9］王春暉，喬寵，戴顯偉，等.人胰腺癌KiSS-1基因m-RNA表達(dá)及其臨床意義.［J］.中華腫瘤防治雜志，2006，13（3）：207 －210.

［10］Moon W S，Rhyu K H，Kang M J，et al.Overexpression of VEGF and angiopoietin 2：a key to high vascularity of hepatocellular carcinoma？［J］.Mod Pathol，2003，16（6）：552－557.

［11］Yoshiji H，Noguchi R，Kuriyama S，et al.Different cascades in the signaling pathway of two vascular endothelial growth factor （VEGF）receptors for the VEGF-mediated murine hepatocellular carcinoma development［J］.Oncology Reports，2005，13 （5）：853－857.

Exp ression and Clinical Significance of KiSS-1 and VEGF in Hepatocellu lar Carcinom a

PAN Meng-yin，ZHAO Jian-long，YUAN Shuan，et al
（Medical College，Henan University of Science and Technology，Luoyang 471003，China）

ObjectiveTo observe the expression of metastasis suppressor gene KiSS-1 and vascular endothelial growth factor（VEGF）in hepatocellular carcinoma（HCC），and explore its clinical significance.MethodsThe expressions of KiSS-1 protein and VEGF were detected by immunohistochem istry in 33 cases of HCC tissue，25 cases of tumor-surrounding tissue and 20 cases of normal liver tissue. Resu lts The positive rate of KiSS-1 protein and VEGF in HCC tissue were 27.27%（9／33），81.82%（27／33）respectively；and in tumor-surrounding tissue and normal liver tissue were 72.00%（18／25），52.00%（9／25）and 85.00%（17／20），45.00%（9／20）（P＜0.05）respectively.The expressions of KiSS-1 protein and VEGF were both related with clinical stages，differentiation degree and lymph node metastasis.There was a negative correlation between the expressions of KiSS-1 protein and VEGF in HCC.（r＝－0.770，P＜0.05）.ConclusionThe expression of KiSS-1 protein is visibly decreased in HCC tissue，and the expression of VEGF is increased，one＇s positive rate was negatively correlated with the other one，which may be involved in tumor genesis，invasion，and metastasis.

hepatocellular carcinoma；KiSS-1 protein；VEGF；invasion；metastasis

R735.7

A

1672－688X（2012）04－0244－03

1.河南省教育廳自然科學(xué)研究項(xiàng)目（2007310002）

2.河南科技大學(xué)大學(xué)生研究訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目（2012182）

2012－08－24

河南科技大學(xué)醫(yī)學(xué)院，河南洛陽(yáng)471003

潘夢(mèng)音（1992－），女，河南平頂山人，臨床醫(yī)學(xué)2010級(jí)在讀本科生。

趙建龍，男，副教授，E－mail：yxyzjl20861＠163.com