芍藥苷對(duì)過(guò)氧化氫誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞PCNA及Caspase-3表達(dá)的影響

周 潔，曹鵬濤，馮凱祥，賈巖巖，羅雪婷，潘夢(mèng)音，溫新麗，于甜甜，楊五彪

·基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)·

芍藥苷對(duì)過(guò)氧化氫誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞PCNA及Caspase-3表達(dá)的影響

周 潔，曹鵬濤，馮凱祥，賈巖巖，羅雪婷，潘夢(mèng)音，溫新麗，于甜甜，楊五彪

目的探討芍藥苷對(duì)過(guò)氧化氫（H2O2）誘導(dǎo)SH-SY5Y氧化損傷的保護(hù)作用及其可能機(jī)制。方法MTT法測(cè)定細(xì)胞存活率，細(xì)胞免疫化學(xué)技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞細(xì)胞核增殖抗原（PCNA）、Caspase-3的表達(dá)。結(jié)果0.87 mmol／L H2O2可使細(xì)胞存活率降低，PCNA的表達(dá)減少，Caspase-3的表達(dá)增加。經(jīng)過(guò)39μg／m L和62.5μg／m L濃度的芍藥苷處理后，H2O2誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞存活率明顯升高，PCNA的表達(dá)明顯增加，同時(shí)抑制Caspase-3的表達(dá)。結(jié)論芍藥苷可抑制過(guò)氧化氫誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞凋亡，其作用機(jī)制可能與其增加細(xì)胞PCNA的表達(dá)，減少Caspase-3的表達(dá)有關(guān)。

芍藥苷；過(guò)氧化氫；SH-SY5Y細(xì)胞；凋亡

凋亡是神經(jīng)細(xì)胞死亡的主要機(jī)制，而且病灶周圍都要產(chǎn)生大量的活性氧自由基（reactive oxygen species，ROS）。細(xì)胞內(nèi)ROS累積、線粒體膜電位（MMP）下降是氧化應(yīng)激誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、引起細(xì)胞損傷的關(guān)鍵因素［1］，因此可以把減輕氧化應(yīng)激作為藥物作用的靶點(diǎn)之一，用于神經(jīng)保護(hù)藥物的篩選。芍藥苷（paeoniflorin，PF）具有抗自由基損傷，提高用于清除ROS的抗氧化物活性及降低MDA水平，對(duì)D-半乳糖和亞硝酸鈉誘導(dǎo)的神經(jīng)元損傷具有保護(hù)作用［2］。本文用H2O2造成人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞株（SH-SY5Y）細(xì)胞凋亡模型，觀察不同濃度芍藥苷對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞的抗凋亡效果，以探討芍藥苷對(duì)神經(jīng)元細(xì)胞保護(hù)的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 藥物與試劑芍藥苷（西安昊軒生物科技有限公司，批號(hào)：20110518，純度為98%），四唑鹽（MTT），小牛血清、DMEM（Gibco BRL公司）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及藥物處理人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞株（SH-SY5Y）（中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所）。細(xì)胞用含2 mmol／L谷氨酰胺和10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)基，在37℃5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。隔天傳代細(xì)胞，當(dāng)傳代細(xì)胞在倒置顯微鏡下觀察均勻貼壁生長(zhǎng)時(shí)，可用于實(shí)驗(yàn)研究。

1.3 M TT法檢測(cè)H2O2對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞的損傷作用將生長(zhǎng)狀態(tài)良好的SH-SY5Y細(xì)胞以1×104細(xì)胞／孔接種于96孔板，待細(xì)胞貼壁。細(xì)胞貼壁后棄去培養(yǎng)液，每孔加含不同濃度H2O2的培養(yǎng)液200 μL。陰性對(duì)照組加不含H2O2的培養(yǎng)液200μL。繼續(xù)培養(yǎng)44 h每孔加入5 mg／m L MTT溶液20μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后棄去培養(yǎng)液，每孔加入200μL DMSO，震蕩5 m in后酶標(biāo)儀檢測(cè)490 nm處每孔的吸光度（OD）值。細(xì)胞存活率＝給藥組OD值／陰性組OD 值×100%。Orgin軟件計(jì)算半數(shù)抑制率（IC50）。

1.4 M TT法測(cè)定PF對(duì)H2O2、SH-SY5Y細(xì)胞損傷的保護(hù)作用取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SH-SY5Y細(xì)胞，以1 ×104細(xì)胞／孔接種于96孔板，待細(xì)胞貼壁。細(xì)胞貼壁后模型組以0.87 mmol／L H2O2作用于SH-SY5Y細(xì)胞。治療組分別以不同濃度PF和0.87 mmol／L H2O2作用于SH-SY5Y細(xì)胞。治療組PF以7.8～1 000μg／m L作用于SH-SY5Y細(xì)胞。對(duì)照組只加SH-SY5Y細(xì)胞，不加藥物。細(xì)胞給藥44 h每孔加20 μL濃度為5 mg／m L的MTT溶液。繼續(xù)培養(yǎng)4 h后棄去培養(yǎng)液，每孔加入200μL DMSO，震蕩5 m in后酶標(biāo)儀490 nm處檢測(cè)吸光度值（OD）。檢測(cè)方法同方法1.3。

1.5 細(xì)胞免疫化學(xué)技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞PCNA、Caspase-3的表達(dá)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期SH-SY5Y細(xì)胞消化制備細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×104／m L，接種于內(nèi)置無(wú)菌玻片的9孔板內(nèi)（2 m L／孔）。培養(yǎng)24 h后，分6組，芍藥苷終濃度分別為39和62.5μg／m L，對(duì)照組不加藥物。以上各組平行3孔，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，爬片用PBS漂洗2遍，經(jīng)4%多聚甲醛固定30 min，PBS洗滌后自然風(fēng)干。檢測(cè)方法按免疫組化試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。測(cè)定值以±s表示，組間比較用t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 過(guò)氧化氫及芍藥苷對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞存活率的影響 MTT分析表明，0～6.0 mmol H2O2的處理48 h，呈濃度依賴性地降低SH-SY5Y細(xì)胞的存活率。而H2O2對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞IC50為0.87 mmol／L，見(jiàn)圖1和圖2。

2.2 SH-SY5Y細(xì)胞PCNA、Caspase-3的表達(dá)結(jié)果PCNA表達(dá)于細(xì)胞核中，而Caspase-3表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)中，染色陽(yáng)性信號(hào)呈棕黃色。與空白組相比，模型組SH-SY5Y細(xì)胞PCNA的表達(dá)明顯減少，Caspase-3的表達(dá)明顯增多；芍藥苷組PCNA表達(dá)顯色則較模型組明顯增強(qiáng)，呈強(qiáng)陽(yáng)性染色，且陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯增加，Caspase-3的表達(dá)明顯減少。見(jiàn)圖3和圖4。應(yīng)的胞漿胞核底物，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡［6］。芍藥苷具有免疫調(diào)節(jié)、鎮(zhèn)痛、保肝、抗腫瘤、抗炎、改善學(xué)習(xí)記憶行為等作用，研究發(fā)現(xiàn)，芍藥苷對(duì)神經(jīng)元的生長(zhǎng)存活具有促進(jìn)作用，并可顯著提高多種鈣超載損傷模型中的大鼠神經(jīng)細(xì)胞的存活數(shù)［7］。

圖1 不同H2O2濃度對(duì)細(xì)胞存活率的影響

圖2 芍藥苷抗H2O2誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞細(xì)胞毒性

圖3 芍藥苷對(duì)H2O2誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞PCNA表達(dá)的影響

圖4 芍藥苷對(duì)H2O2誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞Caspase-3表達(dá)的影響

本文以H2O2處理SH-SY5Y細(xì)胞，制備氧化應(yīng)激損傷模型，探討PF對(duì)過(guò)氧化氫誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞凋亡的抗氧化作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，PF可以減輕H2O2誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞毒性作用，而在39～312.5 μg／m L范圍內(nèi)呈濃度依賴性的抑制H2O2引起的細(xì)胞毒性作用明顯提高細(xì)胞的存活率，提示PF具有神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)作用，能對(duì)抗H2O2引起的細(xì)胞凋亡。H2O2損傷后SH-SY5Y細(xì)胞核增殖因子PCNA的表達(dá)則明顯減少，Casepase-3的表達(dá)明顯增加，而PF能明顯促進(jìn)PCNA表達(dá)，同時(shí)抑制Casepase-3的表達(dá)。PF具有抗氧化應(yīng)激損傷的效應(yīng)，增加了細(xì)胞的存活率，同時(shí)明顯促進(jìn)PCNA表達(dá)，抑制Casepase-3的表達(dá)，為進(jìn)一步研究芍藥苷的神經(jīng)保護(hù)作用提供了依據(jù)。

3 討論

近年來(lái)，氧化應(yīng)激被認(rèn)為是一些神經(jīng)退行性疾病、帕金森綜合征以及多發(fā)性硬化癥等嚴(yán)重危害人類健康疾病的主要原因。其中活性氧在神經(jīng)退行性疾病的發(fā)病過(guò)程中扮演著舉足輕重的角色，腦組織的氧化代謝率很高，過(guò)氧化氫酶活性低，比其他部位更容易受到活性氧作用的影響。氧化應(yīng)激誘發(fā)的自由基損傷是導(dǎo)致神經(jīng)元凋亡的基本原因之一，因此抗氧化是保護(hù)神經(jīng)元的有效途徑。

H2O2是氧化應(yīng)激反應(yīng)密切相關(guān)的活性氧之一，其主要產(chǎn)物具有很強(qiáng)的氧化性并可自由進(jìn)入細(xì)胞，在許多神經(jīng)元細(xì)胞培養(yǎng)模型中可引起細(xì)胞損傷，且許多中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病都涉及到氧化應(yīng)激損傷［3－4］。增殖細(xì)胞核抗原（PCNA）是DNA聚合酶δ的輔助蛋白，參與調(diào)節(jié)DNA的合成，與細(xì)胞的增殖周期密切相關(guān)。PCNA是伴隨細(xì)胞增殖而表達(dá)的一種核內(nèi)蛋白，可作為一項(xiàng)評(píng)估細(xì)胞增殖狀態(tài)的指標(biāo)［5］。Casepase家族在介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的過(guò)程中起著非常重要的作用，其中Casepase-3為關(guān)鍵的執(zhí)行分子，與DNA斷裂、染色質(zhì)凝聚和凋亡小體形成有關(guān)。Casepase-3在正常狀態(tài)下以酶原的形式存在于胞漿中，沒(méi)有活性，但在細(xì)胞發(fā)生凋亡階段，它被激活，活化的Casepase-3由兩個(gè)大亞基和兩個(gè)小亞基組成，它可以水解多聚ADP核糖多聚酶（PARP），裂解相

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Effect of Paeoniflorin on Exp ression of PCNA and Caspase-3 in Peroxide-induced SH-SY5Y Cells

ZHOU Jie，CAO Peng-tao，F(xiàn)ENG Kai-xiang，et al
（Medical College，Henan University of Science and Technology，Luoyang 471003，China）

ObjectiveTo study the protective effect of paeoniflorin（PF）on hydrogen peroxide（H2O2）-induced oxidative injury in SH-SY5Y.MethodsTo measure the cell viability of SH-SY5Y with MTT assay，the expression of PCNA and Caspase-3 was determined with immunohistochemicalmethod.Results0.87 mmol／L H2O2could significantly induce oxidative injury of SH-SY5Y cell viability，decrease the expression of PCNA，increase the expression of Casepase-3.In the presence of 39，62.5μg／m L PF，H2O2-induced cell viability was increased.With immunocytochem ical analysis，a up-regulation PCNA expression and a down-regulated Caspase-3 expression was observed.ConclusionPF could protect against H2O2－induced SH-SY5Y cell apoptosis，which mechanism is correlated with PCNA up-regulation and Caspase-3 down-regulation.

peoniflorin；hydrogen peroxide；SH-SY5Y cell；apoptosis

R774

A

1672－688X（2012）04－0241－03

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31171256）

河南省醫(yī)學(xué)科技攻關(guān)項(xiàng)目（201003079）

河南科技大學(xué)大學(xué)生研究訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目（2012192）

2012－10－12

河南科技大學(xué)醫(yī)學(xué)院，河南洛陽(yáng)471003

周潔（1991－），女，河南陜縣人，臨床醫(yī)學(xué)2010級(jí)在讀本科生。

楊五彪，男，教授，E-mail：ywbiao＠m(xù)ail.haust.edu.cn