產(chǎn)殼聚糖酶菌株的單因素及復(fù)合條件誘變育種*

王艷君，廖春林

(福建師范大學(xué)福清分校生化系，福建福清350300)

殼聚糖酶(Chitosanase，EC3.2.1.99)是水解殼聚糖制備殼寡糖的專一性水解酶之一，是一種不同于幾丁質(zhì)酶的新酶，是能夠水解完全脫乙?；臍ぞ厶?。國(guó)內(nèi)外大量研究表明，殼聚糖酶可以提高植物抗性、防治病蟲害、提高農(nóng)作物產(chǎn)量等。另外，其水解產(chǎn)物殼寡糖(Chitooligosaccharides，簡(jiǎn)稱COSs)則具有獨(dú)特的生理活性和功能，可提高機(jī)體免疫力、抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、在人體腸道內(nèi)可活化增殖雙歧桿菌、降低血壓等，同時(shí)殼寡糖還具有抗菌防腐、保水保濕等性能，其在醫(yī)藥、食品、化妝品等工業(yè)中具有廣闊的應(yīng)用前景［1－2］。

目前殼聚糖酶已商品化，但由于原始出發(fā)菌株產(chǎn)殼聚糖酶能力仍較低，使得殼聚糖酶的生產(chǎn)成本偏高，限制了殼聚糖酶的實(shí)際應(yīng)用。因此，篩選高產(chǎn)殼聚糖酶的菌株以及通過誘變等方式提高殼聚糖酶產(chǎn)量的研究具有重要的理論和實(shí)際意義。已報(bào)道的產(chǎn)殼聚糖酶的微生物主要有:腸桿菌(Enterobacter sp.)［3］、鏈霉菌(Streptomyces spp.)［4］、芽孢桿菌(Bacillus sp.)［5］、假單胞菌(Psuedomanas sp.)［6］、擬無枝桿菌(Amycolatopsis sp.)［7］、粘細(xì)菌(Myxobacter sp.)［8］、金桿菌(Aureobacterium sp.)［9］、諾卡氏菌(Nocardia orientalis)［10］、木 霉 (Trichoderma.reesei)［11］、青 霉 (Penicillum islandicum)［12］、毛 霉 (Mucor rouxii)［13］、曲霉(Aspergillus fumigatus)［14］、鐮孢菌(Fusarium solani)［15］、白僵菌(Beauveria bassiana)［16］、紅酵母(Rhodotorula gracilis)［17］等。本研究以土壤中分離篩選得到的一株產(chǎn)殼聚糖酶的青霉菌M2為出發(fā)菌株，結(jié)合物理及化學(xué)復(fù)合誘變方法，探討不同的誘變方法對(duì)提高該菌株產(chǎn)殼聚糖酶活力的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

青霉菌M2由本實(shí)驗(yàn)室從福建沿海潮間帶泥樣中篩選得到，作為碳源的水溶性殼聚糖購(gòu)自浙江金殼有限公司。其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 培養(yǎng)基

誘導(dǎo)產(chǎn)酶培養(yǎng)基:水溶性殼聚糖1.0%，硫酸銨1.87%，氯化鈉 0.5%，MgSO4·7H2O 0.13%，K2HPO4·3H2O 0.14%，KH2PO40.03%，酵母提取物 0.3%，葡萄糖 0.1%，pH 6.5。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 孢子懸液的制備

用無菌接種環(huán)挑取一環(huán)M2菌株于已滅菌的液體培養(yǎng)基中，放入搖床150 r/min，30℃下培養(yǎng)72 h，取適量菌液于離心管中，在4000 r/min下離心10 min，取上清液，在相同條件下再離心1次，取上清液。用無菌水將孢子懸液稀釋到107～108個(gè)/mL，即制成孢子懸液。

1.3.2 紫外線誘變

取適量孢子懸液于培養(yǎng)皿中，在距離為30 cm，功率為15 W的紫外燈下照射，照射時(shí)間分別為1 min、2 min、3 min、4 min、5 min、6 min、7 min 和8 min，分別編號(hào)為1、2、3、4、5、6、7 和8。將誘變后的孢子懸液在紅光條件下梯度稀釋至濃度為1.0×10－5個(gè)/mL后涂平板。以未處理的菌懸液涂平板作對(duì)照，編號(hào)為0(重復(fù)3次)，于28℃避光培養(yǎng)3 d，計(jì)算致死率，挑取菌株并搖瓶培養(yǎng)，測(cè)定菌株的酶活力。

致死率(%)=(誘變后菌株數(shù)－對(duì)照組菌株數(shù))/對(duì)照組菌株數(shù)×100%

酶活單位:每分鐘產(chǎn)生1μmol還原糖所需的酶量為一個(gè)殼聚糖酶活力單位(U)。

1.3.3 亞硝酸鈉誘變

用無菌水將孢子懸液系列梯度稀釋至1.0×10－5個(gè)/mL，取2.0 mL懸液和0.1 mol/L的NaNO21.0 mL 混勻，28℃下分別保溫1 min、2 min、3 min、4 min、5 min、6 min 和 7min，然后加入 0.2 mol/L，pH 為4.4的醋酸緩沖液1.0 mL，在28 ℃保溫10 min，加入2.0 mL pH 為8.6的 Na2HPO4中和，各取0.1 mL涂布平板，3次重復(fù)，以未處理的菌懸液涂平板作對(duì)照，于28℃避光培養(yǎng)3 d，計(jì)算致死率后，挑致死率最高的菌株進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)，測(cè)定菌株的酶活力。

1.3.4 亞硝酸鈉和紫外線復(fù)合誘變處理

根據(jù)紫外線和NaNO2對(duì)孢子液的處理結(jié)果，確定復(fù)合誘變中紫外線照射的時(shí)間和NaNO2誘變時(shí)間，將紫外線照射后的孢子懸液稀釋后加入NaNO2誘變一定的時(shí)間(重復(fù)3組)，再將誘變后的孢子懸浮液適當(dāng)稀釋后，吸取0.1 mL，涂平板，于28℃避光培養(yǎng)3 d，計(jì)算致死率，挑取少量的菌株進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)，測(cè)定菌株的酶活力［18］。

2 結(jié)果與分析

2.1 紫外線誘變劑量的確定

紫外線對(duì)產(chǎn)殼聚糖酶M2菌株的致死效應(yīng)和酶活力效應(yīng)分別見圖1和圖2。

圖1 紫外線誘變條件下的M2菌株的致死率

圖2 紫外線誘變條件下的突變菌株的酶活力測(cè)定

從圖1中可以看出:隨著紫外線對(duì)孢子處理時(shí)間的延長(zhǎng)，致死率增大，在紫外線處理時(shí)間為4 min時(shí)的致死率為63.33%，其菌株酶活力高達(dá)6.5 U/mL(圖2)，因此將紫外線的處理時(shí)間確定為4 min。

2.2 亞硝酸鈉誘變劑量的確定

亞硝酸鈉對(duì)產(chǎn)殼聚糖酶M2菌株的致死效應(yīng)和酶活力效應(yīng)分別見圖3和圖4。

圖3 亞硝酸鈉誘變條件下的M2菌株的致死率

圖4 亞硝酸鈉誘變條件下的突變株的酶活力測(cè)定

由圖3可知:隨著亞硝酸鈉對(duì)孢子處理時(shí)間的延長(zhǎng)，致死率增大，在亞硝酸鈉(NaNO2)處理時(shí)間為4 min時(shí)的致死率為66.67%，其菌株酶活力高達(dá)6.125 U/mL(圖4)，為所處理組中效果最好的。因此將亞硝酸鈉的處理時(shí)間確定為4 min。

2.3 紫外線和亞硝酸鈉復(fù)合誘變劑量的確定

根據(jù)紫外線誘變和亞硝酸鈉誘變的結(jié)果，在復(fù)合誘變中將紫外線的照射時(shí)間確定為4 min，亞硝酸鈉的誘變時(shí)間確定為4 min。將復(fù)合誘變組定為:(1):紫外照射3 min，亞硝酸鈉處理3min;(2):紫外照射3.5 min，亞硝酸鈉處理3.5 min;(3):紫外照射4 min，亞硝酸鈉處理4 min;(4):紫外照射4.5 min，亞硝酸鈉處理4.5 min;(5):紫外照射5 min，亞硝酸鈉處理5 min;(6):紫外照射5.5 min，亞硝酸鈉處理5.5 min。紫外線和亞硝酸鈉復(fù)合誘變對(duì)產(chǎn)殼聚糖酶M2菌株的致死效應(yīng)及酶活力效應(yīng)分別見圖5和圖6。

圖5 復(fù)合誘變的致死效應(yīng)

圖6 復(fù)合誘變的酶活力效應(yīng)

從圖5中可以看出:隨著復(fù)合誘變對(duì)孢子處理時(shí)間的延長(zhǎng)，致死率增大，在復(fù)合誘變處理時(shí)間為4.5 min時(shí)的致死率為70%，其菌株酶活力高達(dá)8.135 U/mL，比原出發(fā)菌株提高了1.381倍，為所處理組中效果最好的。由此可見，復(fù)合誘變效果要優(yōu)于單一的紫外線或亞硝酸鈉誘變效果，酶活性較之紫外線誘變后提高了25.15%，比亞硝酸鈉誘變后的菌株提高了32.82%。

3 結(jié)束語

在微生物發(fā)酵生產(chǎn)實(shí)踐中，微生物優(yōu)良菌種的選育是一項(xiàng)極其重要且必須長(zhǎng)期堅(jiān)持的工作。微生物誘變育種具有速度快、收效大、方法簡(jiǎn)單等優(yōu)勢(shì)，它是菌種選育的一個(gè)重要途徑［19－20］。傳統(tǒng)的誘變育種仍是大多數(shù)工業(yè)微生物育種最重要、最有效的技術(shù)［18、21］，在菌種篩選中應(yīng)用廣泛。誘變育種方法眾多，目前國(guó)內(nèi)微生物育種主要采用的仍是常規(guī)的物理因子誘變方法、化學(xué)因子誘變方法和復(fù)合誘變育種。

紫外線是一種歷史悠久、效果好、設(shè)備簡(jiǎn)單、值得推廣的一種誘變方法。亞硝酸鈉是常用的烷化劑，應(yīng)用廣泛，突變率也高，和紫外線一起對(duì)菌株進(jìn)行復(fù)合誘變能增強(qiáng)紫外線的誘變效應(yīng)。梁亮［22］等研究表明，以1株谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum)S6為出發(fā)菌株，利用紫外線(UV)、亞硝酸鈉(NaNO2)、紫外線與亞硝酸鈉復(fù)合誘變，最終篩得3株突變菌株，產(chǎn)量提高了1.9% ～7.14%。其研究結(jié)果顯示，經(jīng)紫外線與亞硝酸鈉復(fù)合誘變后的菌株F6產(chǎn)L－組氨酸的產(chǎn)量最高，比亞硝酸鈉誘變后的菌株產(chǎn)L－組氨酸量提高2.06%，比紫外線誘變后的菌株產(chǎn)L－組氨酸量提高5.24%。劉春芬［23］等研究表明:紫外線、亞硝酸鈉誘變因子對(duì)綠色木霉13010菌體細(xì)胞的致死作用表現(xiàn)出相似的趨勢(shì)，在一定范圍內(nèi)都與誘變劑量呈線性正相關(guān)。在協(xié)同誘變條件下，多輪反復(fù)誘變綠色木霉13010后，菌株的酶活力有大幅提高，最終得到產(chǎn)纖維素酶活力提高了70.63%的菌株。本研究利用紫外線和亞硝酸鈉對(duì)產(chǎn)殼聚糖酶M2菌株進(jìn)行復(fù)合誘變所得的高產(chǎn)殼聚糖酶菌株的酶活力高達(dá)8.135 U/mL，比原出發(fā)菌株提高了1.381倍，比紫外線誘變后的產(chǎn)殼聚糖酶菌株提高了25.15%，比亞硝酸鈉誘變后的菌株提高了32.82%。

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