粗砂-礫石海灘溢油污染的現(xiàn)場(chǎng)生物修復(fù)

梁生康，周 平，李廣茹，陳 宇，郭利果，楊仕美，吳 亮

(1. 中國(guó)海洋大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，青島 266100；2. 中國(guó)海洋大學(xué)海洋化學(xué)理論與工程技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青島 266100；3. 中海石油環(huán)保服務(wù)有限公司，天津 300452)

粗砂-礫石海灘溢油污染的現(xiàn)場(chǎng)生物修復(fù)

梁生康1,2，周 平1,2，李廣茹3，陳 宇3，郭利果1,2，楊仕美1,2，吳 亮1,2

(1. 中國(guó)海洋大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，青島 266100；2. 中國(guó)海洋大學(xué)海洋化學(xué)理論與工程技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青島 266100；3. 中海石油環(huán)保服務(wù)有限公司，天津 300452)

在天津港六號(hào)碼頭的粗砂-礫石海灘進(jìn)行了人工模擬溢油條件下的生物修復(fù)現(xiàn)場(chǎng)實(shí)驗(yàn)，考察了添加水溶性肥料、添加緩釋肥料以及同時(shí)添加緩釋肥料和石油烴降解菌等修復(fù)措施的有效性．結(jié)果表明，在 120,d的修復(fù)時(shí)間內(nèi)，同時(shí)添加緩釋肥料和石油烴降解菌的體系石油烴生物降解常數(shù)(ks)最高，達(dá)0.007,2,d-1，為對(duì)照體系的 2.4倍，該體系中氮、磷濃度和石油烴降解菌數(shù)量在較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)都維持較高水平，表明接種的石油烴降解菌能夠直接利用緩釋肥料所釋放出來的營(yíng)養(yǎng)元素而快速生長(zhǎng)繁殖；添加水溶性肥料的體系短期內(nèi)氮、磷含量顯著提高，石油烴降解菌密度明顯增大，石油烴降解速率加快，ks為對(duì)照試驗(yàn)池的 1.8倍；而添加緩釋肥料的體系氮、磷含量盡管明顯高于對(duì)照體系，ks卻略低于對(duì)照體系，這可能是由于土著微生物無法直接利用緩釋肥料所釋放的營(yíng)養(yǎng)元素，甚至其釋放的尿素在局部形成高氨氮環(huán)境而抑制微生物的生長(zhǎng)．

溢油；海灘；生物修復(fù)；水溶性肥料；緩釋肥料；石油烴降解菌

石油工業(yè)在國(guó)民經(jīng)濟(jì)中占有十分重要的地位，是國(guó)家綜合國(guó)力的重要組成部分，然而隨著石油工業(yè)的飛速發(fā)展，海上溢油事故時(shí)有發(fā)生，而且受石油污染的面積不斷加大，污染程度也日趨嚴(yán)重．大量的石油污染物進(jìn)入環(huán)境，不僅破壞生態(tài)平衡，制約了經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，而且影響到人類健康和生存[1]．

生物修復(fù)技術(shù)具有二次污染少、費(fèi)用低廉等優(yōu)點(diǎn)，已成為現(xiàn)場(chǎng)去除溢油污染的重要選擇途徑．但由于現(xiàn)場(chǎng)生物修復(fù)過程中的影響因素很多，包括海岸線對(duì)波浪及潮汐能的暴露或掩蔽程度、海岸線的坡度、溢油品種及數(shù)量、污染場(chǎng)地的微生物活性、溫度、pH值及營(yíng)養(yǎng)鹽含量等[2]．為了確保在污染場(chǎng)地有效地使用生物修復(fù)技術(shù)，必須在整個(gè)處理過程中的各個(gè)階段通過小試和現(xiàn)場(chǎng)中試對(duì)工程的可行性進(jìn)行研究，包括對(duì)處理場(chǎng)所石油污染物的濃度與分布、微生物的活動(dòng)、介質(zhì)環(huán)境行為及地質(zhì)特征的分析，來選擇生物修復(fù)方案．

本研究在天津市塘沽區(qū)天津港六號(hào)碼頭的潮間帶進(jìn)行，通過模擬溢油污染粗砂-礫石海灘，探討了生物強(qiáng)化即接種石油烴降解菌和生物刺激即添加營(yíng)養(yǎng)鹽或兩種措施同時(shí)使用在生物修復(fù)溢油污染現(xiàn)場(chǎng)中的作用效果，以期為以后大規(guī)模的現(xiàn)場(chǎng)溢油處理提供基礎(chǔ)．

1 材料和方法

1.1 溢油污染海岸線模擬

現(xiàn)場(chǎng)修復(fù)試驗(yàn)在天津市塘沽區(qū)天津港六號(hào)碼頭的潮間帶進(jìn)行，主要為粗砂-礫石基質(zhì)，劃分為并排的4個(gè)試驗(yàn)池(5,m×3,m×1,m，長(zhǎng)×寬×高)．溢油污染海岸線的模擬方法參考文獻(xiàn)[3]，所用 BXPT原油為中國(guó)海洋石油總公司天津分公司從渤海開采的主要油品之一，其 20,℃時(shí)密度為 0.921,7,g/cm3，50,℃時(shí)的動(dòng)力黏度為 21.08,mm2/s，硫、蠟、樹脂和瀝青的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.15%、15.44%、13.21%和1.68%，為典型低黏度高臘中質(zhì)原油．油污染基質(zhì)用海水連續(xù)沖刷15,d后，進(jìn)行生物修復(fù)試驗(yàn)．

1.2 溢油污染海岸線生物修復(fù)試驗(yàn)設(shè)計(jì)

人工溢油后的各試驗(yàn)池的處理如表1所示．其中，1號(hào)試驗(yàn)池添加 BXPT原油、緩釋肥料及混合石油烴降解菌，以考察兩者聯(lián)合使用對(duì)原油的強(qiáng)化降解作用；2號(hào)試驗(yàn)池中添加BXPT原油及水溶性氮磷肥料，以考察水溶性肥料對(duì)原油降解的刺激作用；3號(hào)試驗(yàn)池中添加 BXPT原油及緩釋肥料，以考察緩釋肥料對(duì)原油降解的刺激作用；4號(hào)試驗(yàn)池只添加BXPT原油，作為對(duì)照組考察物理?yè)]發(fā)、光化學(xué)降解以及土著微生物對(duì)石油烴的去除作用．添加的肥料質(zhì)量根據(jù)試驗(yàn)池中原油濃度和基質(zhì)中營(yíng)養(yǎng)鹽的背景濃度，一般滿足C、N和P質(zhì)量比為100∶10∶1；菌劑添加量根據(jù)實(shí)驗(yàn)處理前石油烴降解菌總量，使添加后試驗(yàn)池中石油烴降解菌密度提高 2個(gè)數(shù)量級(jí)左右．試驗(yàn)中添加的水溶性肥料為 200,g,NH4NO3和20,g,KH2PO4；所添加的緩釋肥料為本實(shí)驗(yàn)室自主開發(fā)的硫包衣緩釋肥，核心肥料為尿素和 KH2PO4，包衣層為硫磺，以石臘密封而成．該肥料氮和磷的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為33.2%和4.6%．所添加的石油烴降解菌篩選于天津港六號(hào)碼頭沉積物中，初步鑒定和分析結(jié)果表明，該混合菌中的優(yōu)勢(shì)菌有6種，其中4株屬于芽孢桿菌屬(Bacillus sp.)，另外2株分別屬于不動(dòng)桿菌屬(Acinetobacter sp.)和海桿菌屬(Oceanobacillus sp.)，將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的菌液用硅藻土固定化后作為降解試驗(yàn)的接種物[4]．

1.3 樣品采集和監(jiān)測(cè)頻率

每一試驗(yàn)池分上、下 2個(gè)采樣點(diǎn)，采集土表下5～10,cm深處的土壤樣品，混合均勻，一部分立即測(cè)定石油烴降解菌總數(shù)，一部分用于測(cè)定間隙水中的總氮和總磷，一部分用于測(cè)定石油烴總量和組分．除了石油烴組分每月測(cè)定一次之外，石油烴降解菌總數(shù)、總氮、總磷及石油烴含量每周測(cè)定一次．

1.4 樣品測(cè)定方法

1.4.1 樣品間隙水中總氮和總磷的測(cè)定

將從各試驗(yàn)池所取樣品混合均勻后，稱取 300～500,g樣品8,000,r/min進(jìn)行離心分離15,min后，移取上清液，0.45,μm混合纖維濾膜過濾，稀釋 100倍后加入堿性過硫酸鉀，121,℃高壓鍋中硝化 30,min后，分別采用鎘柱還原法和磷鉬藍(lán)法測(cè)定總氮和總磷[5]．

1.4.2 石油烴降解菌密度的測(cè)定

采用改進(jìn)的多管發(fā)酵法測(cè)定[6]：準(zhǔn)確稱取經(jīng)高溫滅菌的原油 5.00,g，用正己烷定容至 50,mL，得到0.1,g/mL的原油儲(chǔ)備液．移取 20,μL原油儲(chǔ)備液到96微孔板，待正己烷揮發(fā)完全后，再移取 B-H培養(yǎng)基180,μL到96微孔板中；然后移取稀釋到相應(yīng)倍數(shù)的菌懸液 20,μL到相應(yīng)的 96微孔板中，置于恒溫培養(yǎng)箱中 25,℃下培養(yǎng)．微孔板培養(yǎng) 2周，加入 50,μL的 INT(3,g/L)溶液，24,h后觀察培養(yǎng)液顏色的變化，呈紫紅色的孔板計(jì)為陽(yáng)性．根據(jù)每個(gè)梯度顯色的管數(shù)，計(jì)算對(duì)應(yīng)的菌數(shù)．

1.4.3 石油烴含量與組分的測(cè)定

參照文獻(xiàn)[3]方法，主要包括索氏提取、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)、柱層析分離和 GC-MS測(cè)定等．儀器為美國(guó)安捷倫公司的 6,890,N/5,975,B的氣質(zhì)聯(lián)用儀，儀器使用條件參照文獻(xiàn)[7] ．

1.5 石油烴組分生物降解常數(shù)的計(jì)算

鑒于原油在溢漏現(xiàn)場(chǎng)的蒸發(fā)、擴(kuò)散、光氧化、乳化等過程都會(huì)影響其組分和含量，使同一污染源的污染場(chǎng)地存在非均一性與明顯的差異性，無法應(yīng)用重量法來確定石油烴的生物降解．因此，這里采用藿烷作為生物標(biāo)志物來評(píng)價(jià)溢油污染現(xiàn)場(chǎng)石油烴的生物降解效果[8]．這主要是由于藿烷在生物修復(fù)的整個(gè)過程中不被生物降解，且藿烷與原油中的其他組分受化學(xué)和物理風(fēng)化作用的影響基本是一樣的．這樣就能用藿烷損失替代物理和化學(xué)損失，因此，原油生物降解速率sk A- 、藿烷損失速率和總損失速率之間存在的關(guān)系為

式(1)可以轉(zhuǎn)換成

由式(2)變換得到一級(jí)反應(yīng)方程

2 結(jié) 果

2.1 石油烴組分在生物修復(fù)過程中的生物降解率

對(duì)于檢出的碳數(shù)為 14～34的正構(gòu)烷烴組分，其一級(jí)降解常數(shù)sk隨著碳鏈的增長(zhǎng)逐漸減小(見圖1)．其中，C30以上的正構(gòu)烷烴sk在 0.000,1～0.003,2,d-1之間，植烷和姥鮫烷的sk在 0.000,8～0.006,1,d-1之間，C20～C29的正構(gòu)烷烴sk在 0.000,2～0.006,4,d-1之間，C14～C19的正構(gòu)烷烴sk在 0.004,7～0.020,2,d-1之間．這主要是因?yàn)橥闊N碳鏈的增長(zhǎng)使其疏水性增大，生物可利用性降低[10]．

圖1 各修復(fù)體系中烷烴組分的一級(jí)降解速率常數(shù)Fig.1 First-order biodegradation rate constants of alkanes in different experiment plots

進(jìn)一步比較不同試驗(yàn)池中烷烴組分的平均降解速率常數(shù) ks(見表 2)，同時(shí)添加緩釋肥料和接種石油烴降解菌處理體系的 ks最高，達(dá) 0.007,2,d-1，約為對(duì)照試驗(yàn)池的2.4倍；其次為添加水溶性肥料的處理體系，ks約為對(duì)照試驗(yàn)池的 1.8倍；而單獨(dú)添加緩釋肥料處理體系的ks最低，僅為對(duì)照的0.8倍左右．

表2 各試驗(yàn)池中不同烷烴組分的一級(jí)降解常數(shù)Tab.2 Comparison of first-order biodegradation rate constants of alkanes in each experimental pool

2.2 石油烴降解菌總數(shù)在生物修復(fù)過程中的變化

生物修復(fù)過程中，石油烴降解菌是石油烴生物降解的執(zhí)行者，其數(shù)量的高低直接反映生物修復(fù)的過程中各種理化因素是否適宜石油烴降解菌的生長(zhǎng)和繁殖．圖 2表示各試驗(yàn)池中石油烴降解菌細(xì)胞密度(ρcell)在生物修復(fù)過程中的動(dòng)態(tài)變化曲線．由圖 2可知，在實(shí)驗(yàn)初期時(shí)，即基質(zhì)噴灑原油前，各試驗(yàn)池的石油烴降解菌細(xì)胞密度都較低，基本維持在 2.3×105～4.6×106g-1之間，噴灑原油后的7,d內(nèi)，各試驗(yàn)池中菌細(xì)胞密度都快速增大，相對(duì)于溢油前提高了1～2個(gè)數(shù)量級(jí)．對(duì)于只噴灑原油的對(duì)照處理體系，菌細(xì)胞密度在實(shí)驗(yàn)開始階段快速升高，21,d時(shí)菌細(xì)胞密度達(dá)到最高值 2.4×107g-1，然后開始迅速下降，28,d時(shí)菌細(xì)胞密度達(dá)最低值 2.0×104g-1，然后基本保持不變或略有增大；對(duì)于添加水溶性肥料的處理體系，菌細(xì)胞密度在添加肥料當(dāng)天即達(dá)最高值2.3×107g-1，保持 7,d后開始逐步下降，28,d時(shí)降至最低的 2.0× 104,g-1，然后基本維持在 1.0×104～3.0×105,g-1；對(duì)于添加緩釋肥料的處理體系，菌細(xì)胞密度在添加肥料當(dāng)天即達(dá)最高值2.3×107g-1，保持7,d后開始逐步下降，28,d時(shí)降至最低的9.0×103g-1，然后呈現(xiàn)鋸齒狀波動(dòng)，但基本維持在1.0×104～2.0×106g-1之間；對(duì)于同時(shí)添加緩釋肥料和石油烴降解菌劑的處理體系，菌細(xì)胞密度由開始時(shí)的2.3×105g-1升高至7,d時(shí)的2.4×107g-1，然后基本保持不變，在 28,d時(shí)開始減小，42,d時(shí)降至最低的2.0×104g-1，然后基本維持在1.0×104～2.0×106g-1．

圖2 石油烴降解菌細(xì)胞密度隨修復(fù)時(shí)間的變化Fig.2 Variations of the oil-degradating bacteria cell density with bioremediation period

整個(gè)生物修復(fù)過程中石油烴降解菌總數(shù)的平均值見表 3，可以看出，同時(shí)添加菌劑和緩釋肥料的體系菌細(xì)胞密度的平均值最高，達(dá) 7.9×106g-1，而對(duì)照體系和添加水溶性肥料的體系中菌細(xì)胞密度的平均值相當(dāng)，添加緩釋肥料的體系則最低，僅為3.8×106g-1．

表3 修復(fù)過程中各處理體系石油烴降解菌密度和間隙水總氮、總磷平均值Tab.3 Average concentrations of oil-degradating bacteria cell density，TN and TP in the porewater during the whole bioremediation period

2.3 生物修復(fù)過程中基質(zhì)間隙水中氮磷含量的變化

圖3 基質(zhì)間隙水中總氮含量隨降解時(shí)間的變化Fig.3 Variations of concentration of total dissolved nitrogen in substrate porewater with degradation time

圖4 基質(zhì)間隙水中總磷含量隨降解時(shí)間的變化Fig.4 Variations of concentration of total dissolved phosphorus in substrate porewater with degradation time

圖 3和圖 4分別給出了生物修復(fù)過程中基質(zhì)中間隙水的總氮與總磷含量的動(dòng)態(tài)變化曲線．由圖可知，未做任何處理的對(duì)照體系，總氮與總磷的含量較低，分別保持在0.5～30.0,mg/kg和0.05～0.70,mg/kg的范圍內(nèi)．而添加緩釋肥料的體系、添加水溶性肥料的體系和同時(shí)添加菌劑與緩釋肥料的體系，在處理的當(dāng)天，其基質(zhì)中間隙水的總氮與總磷含量都顯著增加，總氮的含量分別達(dá)到129.5、126.3和 220.9,mg/kg，總磷的含量分別達(dá) 1.14、0.98和 0.77,mg/kg，然后各處理體系間隙水中總氮含量隨修復(fù)時(shí)間的增長(zhǎng)而逐漸下降，總磷含量逐漸下降或呈鋸齒狀波動(dòng)．需要指出的是，由于基質(zhì)填充的不均勻以及樣品采集時(shí)深度控制不當(dāng)，樣品基質(zhì)氧化還原環(huán)境有所不同，因而導(dǎo)致總磷含量出現(xiàn)波動(dòng)[11]．但整體而言，相比較添加水溶性肥料的體系，添加緩釋肥料體系的總氮總磷含量能夠在比較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)維持在較高水平．

表 3給出整個(gè)生物修復(fù)過程中各試驗(yàn)池中間隙水的總氮與總磷含量的平均值，由表 3可知，添加緩釋肥料、水溶性肥料及同時(shí)添加菌劑與緩釋肥料的體系中間隙水的總氮含量分別比對(duì)照體系高4.2倍、2.3倍和 6.7倍；總磷含量分別高 1.4倍、0.8倍和 1.3倍．表明水溶性肥料在海水的沖刷過程中會(huì)很快流失，而緩釋肥料能在較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)保持基質(zhì)間隙水中營(yíng)養(yǎng)鹽維持在較高水平．

3 討 論

3.1 營(yíng)養(yǎng)鹽對(duì)溢油污染生物修復(fù)的強(qiáng)化作用

微生物代謝需要氮、磷等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的參與才能順利進(jìn)行．溢油發(fā)生后，碳源供給充足，氮源和磷源常常是烴類生物降解的限制因素，添加適量營(yíng)養(yǎng)物可以促進(jìn)生物降解[12]，間隙水中營(yíng)養(yǎng)鹽的濃度應(yīng)維持在既滿足微生物生長(zhǎng)最大需求但又不會(huì)對(duì)其產(chǎn)生毒害作用的水平．本研究結(jié)果表明，在整個(gè)修復(fù)期間，同時(shí)添加緩釋肥料和石油烴降解菌的處理體系保持了較高的營(yíng)養(yǎng)鹽水平，40,d后總氮和總磷濃度保持在15.2,mg/kg和 0.4,mg/kg左右，分別為對(duì)照試驗(yàn)池的15倍和 3倍；而生物修復(fù)期間石油烴降解菌密度的動(dòng)態(tài)變化(見圖 2)也表明營(yíng)養(yǎng)鹽的添加大大提高了石油烴降解菌的數(shù)量，石油烴一級(jí)降解常數(shù)明顯高于未添加營(yíng)養(yǎng)鹽的對(duì)照體系．這表明基質(zhì)中低營(yíng)養(yǎng)鹽含量是限制微生物降解的主要因素，添加營(yíng)養(yǎng)鹽可以顯著提高生物修復(fù)效率[13]．

進(jìn)一步分析表明，添加緩釋肥料和添加水溶性肥料效果不同，添加水溶性肥料可以暫時(shí)提高間隙水中營(yíng)養(yǎng)鹽水平，促進(jìn)土著石油烴降解菌的生長(zhǎng)，從而提高污染物去除速率；只添加緩釋肥料的體系雖然能在相當(dāng)長(zhǎng)的時(shí)間內(nèi)逐步釋放養(yǎng)分，但是添加緩釋肥料的體系石油烴降解率不僅低于添加水溶性肥料的體系，甚至低于不添加營(yíng)養(yǎng)鹽的對(duì)照體系，這可能是由于緩釋肥料雖然能維持間隙水中營(yíng)養(yǎng)鹽較高水平，但土著微生物可能無法直接利用其中的營(yíng)養(yǎng)元素，甚至其釋放的尿素在局部形成高氨氮環(huán)境，可能抑制微生物的生長(zhǎng)，因此石油烴降解菌數(shù)量和石油烴降解率都較低，但這一結(jié)論需要進(jìn)一步驗(yàn)證．上述分析結(jié)果表明，溢油污染現(xiàn)場(chǎng)營(yíng)養(yǎng)鹽類型及濃度的確定依賴于油品性質(zhì)及環(huán)境條件．這與國(guó)內(nèi)外其他學(xué)者的研究結(jié)果基本一致．Wrenn等[14]研究了不同形態(tài)氮對(duì)輕質(zhì)阿拉伯原油的生物降解作用的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在緩沖能力較差的海水體系中，硝態(tài)氮要優(yōu)于氨態(tài)氮，可能是由于微生物在吸收氨氮的過程中產(chǎn)生的酸性代謝物可能會(huì)抑制原油生物降解過程．然而Jackson等[15]分析發(fā)現(xiàn)，對(duì)于鹽沼地土壤環(huán)境，氨氮的添加效果要優(yōu)于硝態(tài)氮，達(dá)到同樣生物修復(fù)效果所需氨氮的量?jī)H為硝態(tài)氮的 20%．這可能是由于氨氮與有機(jī)質(zhì)的強(qiáng)吸附性使得其不容易從環(huán)境中沖刷損失掉．

3.2 接種石油烴降解菌對(duì)石油烴污染物的強(qiáng)化作用

作為提高污染場(chǎng)地生物修復(fù)效率的主要手段之一，生物強(qiáng)化技術(shù)即在污染場(chǎng)地接種高效污染物降解菌已經(jīng)在溢油污染海岸線的生物修復(fù)過程中獲得了廣泛的應(yīng)用．但現(xiàn)有的室內(nèi)和現(xiàn)場(chǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果對(duì)生物強(qiáng)化措施的有效性一直存在爭(zhēng)議．一些研究者認(rèn)為添加石油污染場(chǎng)地的微生物可以明顯提高石油烴的降解效率[16]，而另外一些實(shí)驗(yàn)結(jié)果卻表明，添加外源菌劑并不能提高污染物的生物降解效率，因?yàn)橐缬臀廴粳F(xiàn)場(chǎng)已經(jīng)存在著大量的石油烴降解菌，并且添加進(jìn)去的外源菌劑很難與土著菌共同作用，也競(jìng)爭(zhēng)不過土著菌[17]．

從本實(shí)驗(yàn)修復(fù)期間石油烴降解菌隨降解時(shí)間的變化可以看出，溢油前土著石油烴降解菌數(shù)量均較低，溢油后的 7～14,d內(nèi)，各試驗(yàn)池中菌細(xì)胞密度都快速增大，相對(duì)于溢油前提高了 1～2個(gè)數(shù)量級(jí)，這表明溢油現(xiàn)場(chǎng)石油烴降解菌數(shù)量豐富，可能不是限制生物修復(fù)的主要因素[18]．

對(duì)比只添加緩釋肥料的體系和同時(shí)添加緩釋肥料和石油烴降解菌劑的體系，可以看出，盡管在修復(fù)期間，體系間隙水中營(yíng)養(yǎng)鹽都維持在較高水平，但只添加緩釋肥料的體系的石油烴降解率并未提高反而有所抑制，而同時(shí)添加緩釋肥料和石油烴降解菌的體系石油烴降解率顯著提高，這可能是由于所選育的石油烴降解菌由高油濃度和高營(yíng)養(yǎng)鹽的培養(yǎng)基中多次富集培養(yǎng)獲得，能夠耐受高濃度的氨氮，接種到修復(fù)場(chǎng)地后能夠利用緩釋肥料所釋放的尿素或分解后形成的氨氮而快速生長(zhǎng)繁殖，并在與土著菌的競(jìng)爭(zhēng)中形成優(yōu)勢(shì)，但這一結(jié)論需要分子生物學(xué)技術(shù)(如 PCRDGGE)在確定微生物群落結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上進(jìn)一步驗(yàn)證．這表明，在現(xiàn)場(chǎng)條件下，緩釋肥料和石油烴降解菌劑聯(lián)合使用，是提高生物修復(fù)效率的最有效手段．實(shí)際上，Rosenberg等[16]的研究也獲得相似的結(jié)果，他們?yōu)榱吮苊馔庠淳?jìng)爭(zhēng)不過土著菌，把一種尿素與能利用這種尿素的石油烴降解菌混合，制備成同時(shí)含有菌劑和氮源的修復(fù)劑，結(jié)果證明在此條件下外源菌劑由于能夠選擇性利用這種肥料而比土著菌更具有競(jìng)爭(zhēng)力，從而提高了生物修復(fù)的效率．

4 結(jié) 論

生物強(qiáng)化和生物刺激在粗砂-礫石海灘的現(xiàn)場(chǎng)生物修復(fù)過程中的作用效果不同．

(1) 盡管溢油場(chǎng)地低營(yíng)養(yǎng)鹽含量是生物修復(fù)現(xiàn)場(chǎng)影響污染物降解的主要因子，但是水溶性肥料的添加可以刺激土著石油烴降解菌的生長(zhǎng)，從而提高石油烴的降解率；但緩釋肥料的作用卻與之相反，這表明利用生物刺激手段加快污染物降解時(shí)，營(yíng)養(yǎng)鹽類型及濃度的確定至關(guān)重要，在適宜的修復(fù)場(chǎng)地要選用適宜的營(yíng)養(yǎng)鹽．

(2) 同時(shí)添加緩釋肥料和石油烴降解菌的修復(fù)體系中石油烴污染物降解率最高，生物修復(fù)效果最好；但在緩釋肥料刺激作用下，外加的石油烴降解菌和土著的石油烴降解菌之間為競(jìng)爭(zhēng)生長(zhǎng)還是協(xié)同生長(zhǎng)及其作用機(jī)制尚不明確，還需要通過分子生物學(xué)的方法來進(jìn)一步研究．

［1］ Head I M，Swannell R P J. Bioremidiation of petroleum hydrocarbon contaminants in marine habitats[J]. Current Opinion in Biotechnology，1999，10(3)：234-239.

［2］ 楊仕美，張翼霄，高光軍，等. 不同碳源富集的石油烴降解菌群結(jié)構(gòu)的分析[J]. 海洋科學(xué)，2009，33(8)：87-92.

Yang Shimei，Zhang Yixiao，Gao Guangjun，et al. Analysis of hydrocarbon-degrading bacterium community structures in enrichment cultures with different carbon sources[J]. Ocean Science，2009，33(8)：87-92(in Chinese).

［3］ 何云馨，石曉勇，楊仕美，等. 溢油污染海岸線生物修復(fù)措施現(xiàn)場(chǎng)應(yīng)用效果評(píng)價(jià)[J]. 環(huán)境科學(xué)與技術(shù)，2011，34(3)：41-49.

He Yunxin，Shi Xiaoyong，Yang Shimei，et al. Evaluation on in-situ bioremediation of a shoreline polluted by oil spill[J]. Environmental Science and Technology，2011，34(3)：41-49(in Chinese).

［4］ 王 琳，羅啟芳. 硅藻土吸附固定化微生物對(duì)鄰苯二甲酸二丁酯的降解特性研究[J]. 衛(wèi)生研究，2006，25(1)：23-25.

Wang Lin，Luo Qifang. Biodegradation of dibutyl phthalate by diatomite adsorptive immobilized microorganism[J]. Journal of Hygiene Research，2006，25(1)：23-25(in Chinese).

［5］ 祝陳堅(jiān). 海水分析化學(xué)實(shí)驗(yàn)[M]. 青島：中國(guó)海洋大學(xué)出版社，2006. Zhu Chenjian. Seawater Analytical Chemistry Experiment[M]. Qingdao：Ocean University of China Press，2006(in Chinese).

［6］ Brian A W，Albert D V. Selective enumeration of aromatic and aliphatic hydrocarbon degrading bacteria by a most-probable number procedure[J]. Canadian Journal Microbiology，1996，42(3)：252-268.

［7］ Wang Z，F(xiàn)ingas M，Blenkinsopp S，et al. Comparison of oil composition changes due to biodegradation and physical weathering in different oils[J]. Journal of Chromatography A，1998，809(1)：89-107.

［8］ Prince R C，Elmendorf D L，Lute J R，et al. 17α (H)，21β(H)-Hopane as a conserved internal marker for estimating the biodegradation of crude oil[J]. Environmental Science and Technology，1994，28(1)：142-145.

［9］ Venosa A D，Suidan M T，Wrenn B A，et al. Bioremediation of an experimental oil spill on the shoreline of Delaware Bay[J]. Environmental Science and Technology，1996，30(5)：1764-1775.

［10］ Leahy J G，Colwell R R. Microbial degradation of hydrocarbon in the environment[J]. Microbiological Reviews，1990，54(3)：305-315.

［11］ Marz C，Poulton S W，Beckmann B，et al. Redox sensitivity of P cycling during marine black shale[J]. Geochimica et Cosmochimica Acta，2008，72(15)：3703-3717.

［12］ Swannell R P J，Lee K，Mcdonagh M. Field evaluations of marine oil spill bioremediation[J]. Microbiological Reviews，1996，60(2)：342-365.

［13］ Lee K，Mora S D. In situ biodegradation strategies for oiled shoreline environments[J]. Environmental Technology，1999，20(8)：783-794.

［14］ Wrenn B A，Haines J R，Venosa A D，et al. Effects of nitrogen source on crude oil biodegradation[J]. Journal of Industrial Microbiology，1994，13(5)：279-286.

［15］ Jackson W A，Pardue J H. Potential for enhancement of biodegradation of crude oil in Louisiana salt marshes using nutrient amendments[J]. Water，Air，and Soil Pollution，1999，109(2)：343-355.

［16］ Rosenberg E，Lagmann R，Kushmaro A，et al. Petroleum bioremediation：A multiphase problem[J]. Biodegradation，1992，3(2/3)：337-350.

［17］ Tagger S，Bianchi A，Julliard M，et al. Effect of microbial seeding of crude oil in seawater in a model system[J]. Marine Biology，1983，78(1)：13-20.

［18］ Pnrice R C，Lessard R R，Clark J R，et al. Bioremediation of marine oil spills[J]. Oil and Gas Science and Technology，2003，58(4)：463-468.

Field-Scale Bioremediation of Coarse Sand-Gravel Beach Contaminated by Oil Spill

LIANG Sheng-kang1,2，ZHOU Ping1,2，LI Guang-ru3，CHEN Yu3，GUO Li-guo1,2，YANG Shi-mei1,2，WU Liang1,2
(1. College of Chemistry and Chemical Engineering，Ocean University of China，Qingdao 266100，China；2. Key Laboratory of Marine Chemistry Theory and Technology，Ministry of Education，Ocean University of China，Qingdao 266100，China；3. China Offshore Environmental Service Company Limited，Tianjin 300452，China)

A series of field bioremediation experiments were undertaken on the coarse sand-gravel beach in Tianjin Port NO. 6 jetty，in which crude oil had been intentionally added into plots to simulate oil spill. The objectives were to evaluate the effectiveness of various bioremediation strategies，including addition of slow-release fertilize(SRF)，addition of water-soluble fertilizer(WSF)and addition of SRF supplemented with oil-degrading bacteria(ODB). The results showed that the plots treated with addition of SRF and ODB had the highest biodegradation rate constant (ks) of hydrocarbons，which was as high as 0.007,2,d-1and was 2.4 times that of the control plot，and accordingly the contents of dissolved nitrogen and phosphorus，as well as the density of ODB could keep a high level in a longer period of time. This indicated that ODB could directly utilize the nutrients realsed from SRF to multiply rapidly. The contents of nitrogen and phosphorus in the plot treated with addition of WSF rose obviously in a short period of time. Meanwhile，the ODB cell densities increased，and the biodegradation constant of hydrocarbons was 1.8 times that of the control plot. However，the oil-degrading rate in the plot treated with addition of SRF were slower than that in the control plot，in spite of the fact that the contents of nitrogen and phosphorus were higher. This may be because thatthe indigenous bacteria growth was not supported by the urea released from SRF，but inhibited by the high local concentrations of ammonium.

oil spill；beach；bioremediation；water-soluble fertilizer；slow-release fertilizer；oil-degrading bacteria

X172

A

0493-2137(2012)04-0343-06

2011-01-14；

2011-05-25.

山東省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(Y2008B28)；中國(guó)海洋大學(xué)與中海石油環(huán)保服務(wù)有限公司聯(lián)合攻關(guān)項(xiàng)目(2006004).

梁生康（1972— ），男，博士，副教授.

梁生康，liangshk@ouc.edu.cn.