乙型肝炎肝硬化患者外周血調(diào)節(jié)性T細(xì)胞頻率及血清IL-1β、IL-6和IL-10水平的變化*

李 晨 邢少軍 段學(xué)章 胡瑾華 柳芳芳 王慧芬 萬謨彬

每年約有2%～6%未經(jīng)治療的慢性乙型肝炎患者進展為乙型肝炎肝硬化[1]。研究表明調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞（Regulatory T cells，Treg cells）和 IL-10 在體內(nèi)發(fā)揮免疫抑制作用，而IL-1β 和IL-6 則發(fā)揮促進炎癥的作用。本文通過檢測未經(jīng)抗病毒治療的乙型肝炎肝硬化患者外周血Treg 細(xì)胞及其亞群頻率和血清IL-1β、IL-6 和 IL-10 水平，以探討其臨床意義。

對象與方法

一、研究對象 選取我院2010年3月至2010年9月間收治的38 例乙型肝炎肝硬化（LC）患者、17 例慢性乙型肝炎（CHB）患者和20 例正常健康對照者。診斷符合我國2000年修訂的《病毒性肝炎防治方案》[2]和2005年《慢性乙型肝炎防治指南》[3]。

二、Treg 細(xì)胞及其亞群頻率和血清IL-1β、IL-6、IL-10 水平的檢測 采集入組人群外周抗凝血10ml，用淋巴細(xì)胞分離液（中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程研究所）分離出外周血單個核細(xì)胞（PBMC），每管取1×106PBMC 進行細(xì)胞染色，第一管加入抗CD4-藻紅蛋白（PE，美國 BD Pharmingen 公司）、抗CD25-多甲藻葉綠素蛋白（Percp，美國 BD Pharmingen 公司）；第二管加入抗 CD4-PE、抗CD39-PE（美國BD Pharmingen 公司）。破除細(xì)胞膜后，第一管加入抗Foxp3-異硫氰酸熒光素（FITC，美國ebioscience 公司），第二管加入抗Foxp3-FITC和抗 CTLA-4-別藻青蛋白（APC，美國 BD Pharmingen公司）進行細(xì)胞內(nèi)染色。運用ACSCalibur 型流式細(xì)胞儀（美國，BD 公司）進行細(xì)胞檢測，用FlowJo5.7 for windows 軟件進行圖像分析，計算CD4+CD25+Foxp3+細(xì)胞占CD4+T 細(xì)胞的百分比作為Treg 細(xì)胞頻率；分析CD39+CD4+Foxp3+細(xì)胞（CD39+Treg 細(xì)胞）與 CTLA-4+CD4+Foxp3+細(xì)胞（CTLA-4+Treg 細(xì)胞）分別占CD4+Foxp3+細(xì)胞的百分比，作為Treg 細(xì)胞亞群的頻率。采用ELISA 法檢測血清 IL-1β、IL-6 和 IL-10 水平（美國 RB 公司）。

三、臨床指標(biāo)檢測 血生化、凝血功能、HBV M和HBV DNA 均在本院臨床檢驗中心常規(guī)進行。

四、統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS13.0 軟件進行分析。計量資料用±s 表示，對符合正態(tài)分布資料的均數(shù)間比較應(yīng)用t 檢驗，對不符合正態(tài)分布的資料應(yīng)用秩和檢驗。直線相關(guān)分析用Pearson 法，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)果

一、三組人群Treg 細(xì)胞及其亞群頻率和血清IL-1β、IL-6、IL-10 水平比較 見表1。

表1 各組Treg 細(xì)胞及其亞群頻率及血清細(xì)胞因子水平（±s）比較

表1 各組Treg 細(xì)胞及其亞群頻率及血清細(xì)胞因子水平（±s）比較

與正常對照組比，① P＜0.01；與 CHB 組比，② P＜0.05，③ P＜0.01

正常人 CHB LC例數(shù) 20 17 38 Treg（%）2.9±0.8 4.3±2.0① 5.7±2.3①②CD39+Treg（%）21.6± 10.2 27.5± 11.0 47.4± 18.6①③CTLA-4+Treg（%）25.2 ± 8.2 27.3± 9.9 33.7 ± 9.5①②IL-1（pg/mL）2.2± 1.1 4.1± 2.8 9.3± 9.9①②IL-6（pg/mL）1.2± 1.5 2.7± 3.3 9.7 ± 10.7①③IL-10（pg/mL）2.8 ± 2.0 3.3± 2.1 6.0 ± 4.2①③

二、代償期與失代償期LC 患者Treg 細(xì)胞及其亞群頻率及血清IL-1β、IL-6 和IL-10 水平比較 見表2。

表2 代償期與失代償期LC 患者Treg 細(xì)胞及其亞群頻率及血清細(xì)胞因子（±s）水平比較

表2 代償期與失代償期LC 患者Treg 細(xì)胞及其亞群頻率及血清細(xì)胞因子（±s）水平比較

與代償期組比，① P＜0.01

代償期 失代償期例數(shù) 18 20 Treg（%）3.9± 1.3 7.3± 1.7①CD39+Treg（%）36.1± 17.5 51.6 ± 13.6①CTLA-4+Treg（%）30.5± 7.7 36.6±10.4 IL-1（pg/mL）7.9±9.3 10.6±10.4 IL-6（pg/mL）6.1 ± 11.2 12.8 ± 9.4①IL-10（pg/mL）5.9 ± 4.7 6.0 ± 3.8

三、LC 患者各項指標(biāo)相關(guān)性分析 Treg 細(xì)胞頻率與 CD39＋Treg 細(xì)胞頻率呈正相關(guān)（r=0.474，P＜0.01），與CTLA-4+Treg 細(xì)胞頻率也呈正相關(guān)（r=0.330，P＜0.05）；Treg 細(xì)胞頻率與 TBil 呈正相關(guān)（r=0.381，P＜0.05），與 ALB 呈負(fù)相關(guān)（r=-0.347，P＜0.05），與 PTA 呈負(fù)相關(guān)（r=-0.549，P＜0.01）；CD39＋Treg 細(xì)胞頻率與 TBil 呈正相關(guān)（r=0.333，P＜0.05），與 AST 呈正相關(guān)（r=0.406，P＜0.05），與PTA 呈負(fù)相關(guān)（r=-0.437，P＜0.01）；CTLA-4+Treg 細(xì)胞頻率與血肌酐呈負(fù)相關(guān)（r=-0.336，P＜0.05），與PTA 呈負(fù)相關(guān)（r=-0.368，P＜0.01）；血清 IL-1β 與IL-6 呈正相關(guān)（r=0.397，P＜0.05）。

四、LC 患者Treg 細(xì)胞及其亞群頻率和血清IL-1β、IL-6、IL-10水平與HBV DNA水平和HbeAg 的關(guān)系 以 HBV DNA 水平≥2×106IU/ml將LC 患者分為高病毒載量組和低病毒載量組，分析得出兩組患者Treg 細(xì)胞及其亞群頻率及血清IL-1β、IL-6、IL-10 水平均無顯著性差異 （P 均＞0.05）。HbeAg 陽性與 HbeAg 陰性 LC 患者 Treg 細(xì)胞及其亞群頻率和血清IL-1β、IL-6、IL-10 水平也無顯著性差異（P 均 ＞0.05）。

討論

本研究發(fā)現(xiàn)外周血Treg 細(xì)胞及其亞群CD39+Treg 細(xì)胞、CTLA-4+Treg 細(xì)胞的頻率和血清IL-1β、IL-6、IL-10 水平在 LC 患者尤其是失代償期患者體內(nèi)明顯增高，這種變化趨勢隨著HBV 慢性感染的嚴(yán)重程度而逐漸明顯[4～7]，但也與一些研究報告相悖，如有研究表明此類患者體內(nèi)IL-1β 水平升高，而 IL-6、IL-10 水平較正常人低[8～12]。

本研究發(fā)現(xiàn)LC 組Treg 細(xì)胞及CD39+Treg 細(xì)胞頻率與TBil 水平均存在正相關(guān)，而Treg 細(xì)胞與反映肝臟合成能力的ALB 存在負(fù)相關(guān)，CD39+Treg 細(xì)胞還與反映肝臟炎癥程度的AST 存在正相關(guān)，反映凝血功能的PTA 則與三種細(xì)胞頻率均存在負(fù)相關(guān)，提示Treg 細(xì)胞及其亞群可能隨著肝硬化程度的加重通過增加頻率的方式發(fā)揮免疫抑制作用，CD39+Treg 細(xì)胞作為功能性Treg 細(xì)胞更多的利用CD39 水解酶活性參與抑制肝臟炎癥。但是肝硬化階段特別是失代償期患者肝臟功能急劇下降并出現(xiàn)不可逆的病理變化，包括CD39+Treg 細(xì)胞、CTLA-4+Treg 細(xì)胞、IL-10 等抗炎因素的增多也不足以延緩IL-1β、IL-6 等促炎因素促進的病情進展。

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