慢病毒載體介導(dǎo)的結(jié)締組織生長(zhǎng)因子基因沉默對(duì)下游基因的影響*

彭梅娟 郝春秋 張 野 謝玉梅 張 巖 白雪帆

抑制結(jié)締組織生長(zhǎng)因子（CTGF）表達(dá)可減緩、抑制甚至逆轉(zhuǎn)肝纖維化的進(jìn)程[1～3]。我們利用前期制備的CTGF siRNA 慢病毒載體轉(zhuǎn)移質(zhì)粒[4]，與包裝質(zhì)粒及包膜蛋白質(zhì)粒共同包裝能介導(dǎo)CTGF 基因沉默的慢病毒載體，感染HSC 后觀察其對(duì)CTGF 及下游相關(guān)基因的抑制作用，為進(jìn)一步闡明CTGF 及HSC在肝纖維化發(fā)病中的作用提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

材料與方法

一、細(xì)胞與材料 293T 細(xì)胞、HSC-T6 細(xì)胞、大腸桿菌菌株DH5α 均由本室保存；含有 CTGF siRNA 的慢病毒載體轉(zhuǎn)移質(zhì)粒 pGCL-TS1-GFP、pGCL-TS2-GFP、pGCL-TS3-GFP、pGCL-TS4-GFP由本實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建并鑒定[4]，其他慢病毒載體包裝系統(tǒng)（包括包裝質(zhì)粒pHelper1.0，包膜蛋白質(zhì)粒p pHelper2.0）購(gòu)自上海吉?jiǎng)P基因技術(shù)有限公司；質(zhì)粒DNA 大量提取試劑盒購(gòu)自Qiagen 公司；脂質(zhì)體Lipofectamine 2000、Trizol 試劑、SuperScript 第 1 鏈cDNA 合成反轉(zhuǎn)錄試劑盒均購(gòu)自Invitrogen 公司；SYBR Master Mix 熒光定量 PCR 試劑盒購(gòu)自Takara 公司；抗CTGF 抗體、抗β-actin 抗體購(gòu)自Abcam 公司；山羊抗兔 IgG-HRP、山羊抗鼠IgG-HRP 購(gòu)自 Santa Cruz 公司；ECL 試劑盒購(gòu)自Amersham 公司。Plus-20 離心超濾裝置購(gòu)自Millipore 公司。

二、含有CTGF siRNA 的慢病毒載體包裝 取293T 細(xì)胞，用 DMEM（10%胎牛血清），在 37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)。將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞于轉(zhuǎn)染前24 小時(shí)接種于15cm 細(xì)胞培養(yǎng)皿中，轉(zhuǎn)染前使細(xì)胞密度達(dá)70%～80%，取含有CTGF siRNA 的轉(zhuǎn)移質(zhì)?；蚩?pGCL-GFP 質(zhì)粒 20μg、pHelper1.0 質(zhì)粒 15μg、pHelper2.0 質(zhì)粒 10μg 共轉(zhuǎn)染 293T 細(xì)胞，轉(zhuǎn)染方法參照Lipofectamine 2000 轉(zhuǎn)染試劑操作說(shuō)明進(jìn)行。轉(zhuǎn)染 48 小時(shí)后收集上清液，3000g、4℃離心 10 分鐘除去細(xì)胞碎片，用0.45μm 濾器過(guò)濾上清液，4000g 離心超濾濃縮病毒，使用逐孔稀釋滴度測(cè)定法進(jìn)行病毒滴度測(cè)定，保存于-80℃?zhèn)溆谩?/p>

三、含有CTGF siRNA 的慢病毒載體感染HSC-T6 細(xì)胞 HSC-T6 細(xì)胞用 DMEM（10%），在37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)。將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞接種于6 孔板中，培養(yǎng)至細(xì)胞密度達(dá)30%～40%，以感染復(fù)數(shù)（MOI）＝100 加入適量的慢病毒濃縮液，12 小時(shí)后觀察細(xì)胞狀態(tài)，如沒有明顯的細(xì)胞毒性作用則繼續(xù)培養(yǎng)48 小時(shí)后更換培養(yǎng)液，感染96 小時(shí)后觀察慢病毒中報(bào)告基因綠色熒光蛋白（GFP）的表達(dá)情況，收集細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

四、蛋白提取和Western 免疫印跡法篩選有效抑制序列 將感染細(xì)胞用PBS 沖洗后置于冰上，加入 150μL 裂解緩沖液（50mmol/LHEPES，pH7.0，1%NP-40，1μg/mL Aprotinin，100μg/mL PMSF），冰上裂解10 分鐘，以細(xì)胞刮收集細(xì)胞并轉(zhuǎn)移至離心管中，超聲破碎儀破碎細(xì)胞，12000g、4℃離心15 分鐘收集上清，用Bradford 法測(cè)定蛋白濃度，取40μg 總蛋白樣本與上樣緩沖液混合，沸水浴5 分鐘，待完全冷卻后上樣，進(jìn)行SDS-PAGE（5%濃縮膠、10%分離膠）；電泳結(jié)束后400mA 恒流轉(zhuǎn)移2 小時(shí)，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上；用封閉液（含5%脫脂牛奶的TBST 溶液）室溫封閉 PVDF 膜 1 小時(shí)后加入抗CTGF 抗體或抗 β-actin 抗體，4℃孵育過(guò)夜；TBST洗膜3 次，每次10 分鐘，加入山羊抗兔IgG-HRP 或山羊抗鼠IgG-HRP，室溫孵育2 小時(shí)；TBST 洗膜3次，每次10 分鐘，按照ECL 試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行顯色，在暗室中壓片、化學(xué)發(fā)光自顯影、洗片。

五、Real-time PCR 法篩選有效抑制序列和檢測(cè)下游基因的表達(dá) 收集感染細(xì)胞，使用Trizol 試劑參照說(shuō)明書提取病毒感染細(xì)胞總RNA，用DEPC處理的去離子水溶解RNA，使用SuperScript 第1鏈cDNA 合成試劑盒，應(yīng)用隨機(jī)引物合成cDNA。以cDNA 為模版，應(yīng)用引物（表1）和 Real-time PCR 試劑盒對(duì)相應(yīng)的目的基因進(jìn)行擴(kuò)增，預(yù)變性95℃ 15秒后，每個(gè)循環(huán)變性95℃ 5 秒、退火延伸60℃ 30秒，共45 個(gè)循環(huán)。

結(jié)果

一、含有不同靶向CTGF siRNA 慢病毒載體的抑制效率 分別用4 種含有不同靶向CTGF siRNA 的慢病毒載體感染HSC-T6 細(xì)胞，以不含siRNA 的慢病毒載體感染細(xì)胞作為陰性對(duì)照組，并同時(shí)設(shè)無(wú)病毒感染細(xì)胞作為對(duì)照組。6 組細(xì)胞分別進(jìn)行Real-time PCR 檢測(cè)其CTGF 基因表達(dá)水平。結(jié)果陰性對(duì)照組CTGF mRNA 相對(duì)表達(dá)水平為0.941±0.074，而含靶向CTGF siRNA 慢病毒載體感染細(xì)胞中 CTGF mRNA 相對(duì)表達(dá)水平分別為 TS1：0.145±0.004、TS2：0.634±0.043、TS3：0.405±0.021、TS4：0.544±0.050，與陰性對(duì)照相比，分別降低84.6%、32.6%、57.0%和42.3%，其中，TS1 組CTGF mRNA 表達(dá)水平的降低與陰性對(duì)照相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（t＝16.245，P＝0.039）。因此，表達(dá)TS1 siRNA 的病毒抑制HSC-T6細(xì)胞中CTGF 表達(dá)的效率最高。Western 免疫印跡法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)內(nèi)參照蛋白β-actin 的表達(dá)水平在6 組之間無(wú)明顯差異，而CTGF 蛋白表達(dá)在TS1 病毒感染組顯著降低（圖1），提示表達(dá)TS1 siRNA 的慢病毒在蛋白水平上取得了最佳的抑制效果，與Real-time PCR 檢測(cè)結(jié)果相符。因此，將表達(dá)靶向CTGF TS1 siRNA的慢病毒命名為：Len/siRNA-CTGF，不含siRNA 的慢病毒命名為：Len/siRNA-NC，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究。

表1 寡核苷酸引物序列

圖1 各組CTGF 的蛋白表達(dá)水平

二、慢病毒載體感染HSC-T6 細(xì)胞的效率 慢病毒載體感染HSC-T6 細(xì)胞96 小時(shí)后在熒光顯微鏡下觀察GFP 的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)Len/siRNA-NC 和Len/siRNA-CTGF 感染的HSC-T6 細(xì)胞中都有GFP表達(dá)，感染效率大于50%（圖2）。

圖2 HSC-T6 細(xì)胞表達(dá)GFP 情況

三、抑制CTGF 對(duì)下游基因表達(dá)的影響 應(yīng)用Len/siRNA-NC 和 Len/siRNA-CTGF 感染 HSC-T6細(xì)胞，培養(yǎng)96 小時(shí)后收集細(xì)胞，進(jìn)行RT-PCR 檢測(cè)TIMP-1、TIMP-2 和 I 型膠原 mRNA 表達(dá)水平，以無(wú)病毒感染細(xì)胞作為對(duì)照組。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在CTGF被抑制的同時(shí)，TIMP-1 表達(dá)水平較陰性對(duì)照組下降約 77%（t＝64.77，P＝0.0002），TIMP-2 表達(dá)下降約 82%（t＝244.9，P＜0.0001），膠原蛋白 I 表達(dá)下降約 50%（t＝9.08，P=0.011）。

討論

CTGF 主要由HSC、纖維母細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞等分泌。研究發(fā)現(xiàn)，CTGF 的過(guò)度表達(dá)，特別是HSC 和纖維母細(xì)胞/ 肌纖維母細(xì)胞中CTGF 的過(guò)度表達(dá)在肝纖維化發(fā)生中可能發(fā)揮重要作用[5]。最新研究表明，CTGF 與抑癌基因p53 上調(diào)基因表達(dá)存在顯著相關(guān)性，在發(fā)生纖維化的肝臟中表達(dá)水平均顯著升高。p53 在人肝細(xì)胞癌細(xì)胞系中也可通過(guò)抑制miR-71-92 上調(diào)CTGF 的表達(dá)。更為重要的是，在小鼠模型中抑制肝臟中p53 蛋白的降解，可導(dǎo)致肝臟CTGF 合成增加，從而誘導(dǎo)肝細(xì)胞凋亡和自發(fā)性肝纖維化的發(fā)生，提示p53 可誘導(dǎo)CTGF 表達(dá)，p53/CTGF 信號(hào)通路可促進(jìn)肝纖維化的進(jìn)展[2]。因此，阻斷CTGF 表達(dá)或抑制其活性，可能作為治療和預(yù)防肝纖維化的靶點(diǎn)。

我們利用前期研究中成功構(gòu)建的含有靶向CTGF siRNA 的慢病毒轉(zhuǎn)移質(zhì)粒，聯(lián)合包裝質(zhì)粒和包膜蛋白質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染293T 細(xì)胞，成功包裝出4株含有CTGF siRNA 的慢病毒載體，這4 株慢病毒載體均可有效感染HSC-T6 細(xì)胞，并發(fā)揮抑制CTGF mRNA 轉(zhuǎn)錄，這與siRNA 及慢病毒載體的作用機(jī)制相符，siRNA 發(fā)生作用的關(guān)鍵環(huán)節(jié)在mRNA，只要細(xì)胞中存在siRNA，無(wú)論其與細(xì)胞DNA 整合還是游離于細(xì)胞中，均可強(qiáng)烈抑制目的基因的轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而影響蛋白表達(dá)[6]。進(jìn)一步應(yīng)用Western 免疫印跡法也證明CTGF 蛋白表達(dá)也受到抑制，最終篩選出抑制效率最高的慢病毒重組株Len/siRNA-CTGF 作為CTGF 基因沉默的工具，為進(jìn)一步研究CTGF 在HSC 活化及肝纖維化中的作用奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

由于肝纖維化的病理過(guò)程復(fù)雜，CTGF 可能誘導(dǎo)多種下游因子，促進(jìn)肝纖維化的進(jìn)程。目前認(rèn)為肝臟細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）的合成與降解失衡，是導(dǎo)致肝纖維化發(fā)展的主要機(jī)制。郭麗梅等人采用一次性大劑量二甲基亞硝胺致大鼠肝纖維化模型，在此模型中可見伴隨肝細(xì)胞再生與肝組織結(jié)構(gòu)修復(fù)重建，由肝星狀細(xì)胞產(chǎn)生的ECM也不斷沉積，沿著中央靜脈之間形成早期肝纖維化的雛形[7]。

ECM 的降解主要由基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）調(diào)控，其活性可被 TIMP 所抑制。其中，TIMP-1 在肝纖維化過(guò)程中對(duì)MMP 的活性抑制在TIMP 家族中作用最強(qiáng)[8]。激活的HSC可使TIMP-1 表達(dá)增加，繼而抑制MMP 活性，使肝臟ECM不能及時(shí)降解，造成堆積，導(dǎo)致肝纖維化乃至肝硬化的發(fā)生[9]。同時(shí)，在正常情況下，HSC 合成的膠原蛋白以III、IV 型為主，而I 型膠原較少，而在肝纖維化時(shí)肝臟Disse 間隙中存在大量的I 型膠原[10]。我們的研究也發(fā)現(xiàn)，在CTGF 表達(dá)抑制的同時(shí)，也可導(dǎo)致 TIMP-1、TIMP-2 和 I 型膠原 mRNA 轉(zhuǎn)錄水平顯著降低，提示CTGF 可能通過(guò)增強(qiáng)TIMP 和I型膠原的表達(dá)，誘導(dǎo)ECM在肝臟的沉積。CTGF 促進(jìn) ECM 合成，TIMP-1 抑制 ECM 降解，在肝纖維化發(fā)生過(guò)程中發(fā)揮協(xié)同促進(jìn)作用[11]。本研究為進(jìn)一步闡明CTGF 及HSC 在肝纖維化中的作用機(jī)制和防治肝纖維化奠定了理論和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

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