內(nèi)毒素在酒精性肝病腸損傷中的作用*

聶 嬌 李 鑫 徐有青

本實驗觀察了酒精性肝病患者內(nèi)毒素水平和酒精誘導小鼠酒精性肝病腸粘膜的損傷情況。

資料與方法

一、標本來源 2010年3月～2010年10月期間來我科住院的男性酒精性肝病患者15 例，年齡47～73歲，平均年齡 56.8±9.0歲。依據(jù) 2010年中國酒精性肝病診療指南的標準[1]診斷。另選擇男性健康人15 例，年齡17～83歲，平均年齡 46.8±18.9歲。清晨空腹抽靜脈血4m1，3000rpm 離心5min，取血清備檢。

二、小鼠酒精性肝病模型的建立 取SPF 級健康雄性C57/BL 小鼠20 只，重量20±3g，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供。將小鼠適應性喂養(yǎng)1 周后隨機分為對照組和模型組，每組10 只。對照組飼喂Lieber-Decarli 無酒精液體飼料，模型組飼喂Lieber-Decarli 含酒精飼料（北京華阜康生物科技股份有限公司，表1），飼養(yǎng)在室溫為24±2℃，濕度為40%～70%、人工日夜循環(huán)照明（照明時間8：00am～5：00pm）的 SPF 級動物實驗室。實驗第 10 周末，小鼠禁食12h，3%水合氯醛（300mg.Kg-1）腹腔注射麻醉，心臟采血，加入真空管（BD 公司），3000 rpm 離心5min。另分別取肝臟組織和距肛門3cm 處結(jié)腸組織，在4%多聚甲醛中固定，制備石蠟切片，常規(guī)HE 染色。

表1 Lieber-DeCarli 液體飼料成份表（1000ml）

三、腸粘膜損傷檢查 在光鏡下，參照Axaki Y[2]及Gulpinar MA[3]報道的結(jié)腸損傷評分法（表2）進行。每組取10 張切片，得分取均值。

表2 病理學判斷結(jié)腸損傷標準

四、血清內(nèi)毒素和丙二醛（MDA）檢測 采用ELISA 法（北京普生瑞達生物技術有限公司和南京建成生物有限公司試劑，VIS-7220 型分光光度計購自北京第二化學儀器廠）。

五、統(tǒng)計學方法 應用SPSS 17.0 軟件進行統(tǒng)計學分析，結(jié)果以均數(shù)±標準差表示。兩組間采用t檢驗，P＜0.05 被認為有統(tǒng)計學意義

結(jié)果

一、血清內(nèi)毒素和MDA 的比較 酒精性肝病患者血清內(nèi)毒素水平較對照組明顯升高，兩組有統(tǒng)計學差異（0.52±0.54 Eu/L 對 0.47±0.34Eu/L，P=0.03）。酒精性肝病患者血清MDA 水平較對照組明顯升高（5.6±5.0nmol/ml 對 3.7±3.4nmol/ml），但兩組無明顯統(tǒng)計學差異（P=0.26）；酒精性肝病模型小鼠血清內(nèi)毒素水平較對照組明顯升高（0.38±0.05 Eu/L 對 0.13±0.02 Eu/L，P=0.00），有明顯統(tǒng)計學意義。

二、小鼠肝臟組織學表現(xiàn) 對照組肝小葉結(jié)構完整、肝索排列整齊，沿中央靜脈呈放射狀分布（圖1A）。模型組肝細胞脂肪變性明顯，肝小葉排列紊亂，有明顯的淤血（圖1B）。

圖1A 對照組肝組織 形態(tài)完整（HE，200×）

圖1B 模型組肝組織 細胞脂肪變性明顯，肝小葉排列紊亂，有明顯的淤血（HE，200×）

三、小鼠腸粘膜形態(tài)學表現(xiàn) 對照組小鼠結(jié)腸粘膜層次清晰，表面光滑、整齊，粘膜上皮和腺體結(jié)構完整，無明顯充血和淋巴細胞浸潤（圖2A）；模型組小鼠結(jié)腸粘膜上皮細胞脫落，上皮細胞與固有層間距增寬，腺體結(jié)構破壞，隱窩變淺，粘膜下層水腫，但無明顯的出血灶（圖2B）；模型組結(jié)腸組織損傷病理學評分為10.3±1.3 分，較對照組4.8±1.2分明顯升高（P=0.01），有明顯的統(tǒng)計學差異。

圖2A 對照組腸粘膜 形態(tài)完整（HE，200×）

圖2B 模型組腸粘膜 上皮細胞脫落，上皮細胞與固有層間距增寬，腺體結(jié)構破壞，粘膜下層水腫（HE，200×）

討論

內(nèi)毒素（LPS）是腸道革蘭陰性桿菌細胞壁的脂多糖，具有高度的免疫活性，并且能誘導大量炎性介質(zhì)的產(chǎn)生。近年來，有研究發(fā)現(xiàn)酒精性肝病患者血漿內(nèi)毒素水平增高，并發(fā)現(xiàn)酒精、內(nèi)毒素和肝損傷三者之間存在著一定的因果關系[4，5]。在酒精性肝病模型大鼠，注射LPS 將會加重大鼠脂肪肝的病變程度，甚至會導致大鼠肝臟的炎性壞死[6～10]，而通過清除腸道細菌或抑制革蘭陰性桿菌生長以降低血漿內(nèi)毒素水平，可明顯減輕酒精導致的肝臟損傷[11～13]。與飲酒＜20g/d 的健康人相比，飲酒＞60g/d 的酒精性肝病患者血漿內(nèi)毒素水平明顯增高。在無肝臟疾病的飲酒頻繁的人群中血漿內(nèi)毒素水平也是升高的[14]。但是停止酒精攝入1 周后，50%以上的輕度酒精性肝炎患者和大多數(shù)酒精性脂肪肝患者內(nèi)毒素血癥是可以逆轉(zhuǎn)的[10]。在我們的臨床研究中發(fā)現(xiàn)酒精性肝病組血清內(nèi)毒素水平較對照組明顯升高，同樣證明了在酒精性肝病患者中存在著內(nèi)毒素血癥。

慢性酒精攝入導致血漿內(nèi)毒素水平升高可能有以下幾個方面的原因：（1）腸道革蘭陰性桿菌過度生長，產(chǎn)生了過多的內(nèi)毒素。Bode 等人研究證明酒精性肝病患者腸道菌群生長數(shù)是不飲酒的正常健康人的3 倍[11]；（2）腸道粘膜對內(nèi)毒素通透性增強；（3）肝臟庫弗細胞對內(nèi)毒素清除能力下降。

酒精性肝病患者是否存在著腸道損傷？在光鏡下觀察人體腸粘膜形態(tài)是診斷腸粘膜損傷最為直觀和準確的方法，但由于在腸鏡下摘取研究對象腸粘膜不僅是一種有創(chuàng)操作，而且易導致腸穿孔等危險并發(fā)癥。所以，我們選擇了檢測血清丙二醛（MDA）含量，因為測量MDA 含量是一種無創(chuàng)操作，并且還可間接地反應組織氧自由基損害的程度和組織膜結(jié)構受損的程度。我們的研究發(fā)現(xiàn)，酒精性肝病組血清MDA 水平較對照組明顯升高，間接證明了酒精性肝病患者存在著腸粘膜損傷。雖然兩組間無明顯統(tǒng)計學差異，考慮可能為MDA 升高有一定的時間依賴性，且與樣本量大小有關。由于我們的標本來源未有明確的時間限定，我們下一步的研究將擴大樣本量，分時間段測量MDA。

為更直接觀察到腸粘膜的形態(tài)，我們用酒精誘導了小鼠酒精性肝病模型，觀察到在小鼠酒精性肝病模型中血清內(nèi)毒素水平較對照組明顯升高，與我們對人體的臨床研究結(jié)果相一致。在對肝臟的形態(tài)學觀察中，模型組肝小葉結(jié)構破壞，明顯脂肪變性，說明長期慢性的酒精攝入已引起小鼠的肝臟損傷。而通過對腸粘膜形態(tài)的觀察中發(fā)現(xiàn)模型組小鼠結(jié)腸粘膜上皮細胞脫落，上皮細胞與固有層間距增寬，腺體結(jié)構破壞，隱窩變淺，粘膜下層水腫，進一步證明了酒精性肝病伴發(fā)了腸粘膜的損傷。

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