酒精培養(yǎng)C3A細(xì)胞NOTCH信號(hào)通路的表達(dá)*

謝 俏 李匯華 李 鑫 徐有青

本實(shí)驗(yàn)研究了Notch 信號(hào)通路在酒精培養(yǎng)C3A細(xì)胞中的表達(dá)以及Notch 信號(hào)通路抑制劑3，5-二氟苯乙酰-L-丙氨酰-S 苯基甘氨酸 t-丁酯（DAPT）對(duì)細(xì)胞增殖的影響。

材料與方法

一、試驗(yàn)細(xì)胞 C3A 細(xì)胞系本實(shí)驗(yàn)室保存。

二、試劑 高糖DMEM 培養(yǎng)基、噻唑藍(lán)（MTT）、95%乙醇購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院細(xì)胞中心；胎牛血清購(gòu)自美國(guó) GIBICO 公司；DAPT 購(gòu)自Sigma-Aldrich 公司；DMSO 購(gòu)自 Bio-Tech 公司；兔抗人NICD1 購(gòu)自加拿大Epitomics 公司；兔抗人HES-1 購(gòu)自Millipore 公司；抗β-actin 抗體購(gòu)自美國(guó) Santa Cruze 公司；鼠抗兔IgG 購(gòu)自美國(guó) Cell Signaling 公司；Trizol 購(gòu)自美國(guó) Invitrogen 公司；發(fā)光液購(gòu)自美國(guó)Millipore 公司。

三、細(xì)胞培養(yǎng)和處理 取C3A 細(xì)胞和CYP2E1 細(xì)胞，加入含體積分?jǐn)?shù)為10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，置于37℃、5% CO2 和飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2～3d 換液，5d 傳代。收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，離心（1000rpm，5min）后棄上清，用1mlDMEM完全培養(yǎng)基重懸、計(jì)數(shù)。根據(jù)文獻(xiàn)[8]的描述，選取100mM為酒精作用濃度，24 小時(shí)為酒精作用時(shí)間，來(lái)模擬體外酒精性肝病模型。用封口膜封住細(xì)胞培養(yǎng)皿和96 孔板，以防酒精揮發(fā)。細(xì)胞在加酒精刺激前用不含胎牛血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)（饑餓）24h。DAPT 組用 10μmol/L DAPT 預(yù)處理 C3A 細(xì)胞和CYP2E1 細(xì)胞24 小時(shí)，然后再加入酒精處理。

四、MTT 法檢測(cè)細(xì)胞增殖 取約3×104細(xì)胞，接種于96 孔板中，細(xì)胞貼壁后處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，按分組情況在培養(yǎng)基中加酒精和DAPT 共培養(yǎng)24h，吸棄培養(yǎng)基，每孔加入 MTT（5.0g/L）20μL，繼續(xù)培養(yǎng)4h，吸棄上清，每孔加入DMSO150μL，避光振蕩15min，應(yīng)用全自動(dòng)酶標(biāo)儀檢測(cè)490nm 處各孔的吸光度A490nm，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，通過(guò)公式計(jì)算細(xì)胞存活率，即細(xì)胞存活率=A 對(duì)照組/A 實(shí)驗(yàn)組×100%

五、Western-blot 檢測(cè)Notch 下游蛋白NICD1和HES1 的表達(dá) 取約2.6×107細(xì)胞，懸于細(xì)胞裂解液中冰浴30min，裂解細(xì)胞，離心（12 000rpm，15min），提取蛋白質(zhì)，定量后取90μg 蛋白與5×加樣緩沖液混勻，100℃變性5min，冷卻后上樣。恒壓電泳2h，4℃下將樣品轉(zhuǎn)移到 PVDF 膜上，TBST 洗滌 3次，5 分鐘 /次。加入兔抗人 NICD1（1：1000）和抗人HES-1（1：500），4℃過(guò)夜，TBST 洗滌 3 次，5 分鐘 /次，加入抗兔二抗（1：3000），室溫振蕩孵育2h，TBST 洗滌3 次，5 分鐘 /次。加入化學(xué)發(fā)光液，暗室中顯影2min，TBST 洗滌，晾干。以β-actin 作為內(nèi)參照。

六、RT-PCR 檢測(cè)Notch1mRNA 水平 在冰上吸棄種有細(xì)胞的60mm 培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)基，PBS 洗滌3 次，每個(gè)培養(yǎng)皿中加入1ml Trizol，冰上裂解提取總RNA，將RNA 溶于DEPC 中，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒中的說(shuō)明進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，按照引物（表1）設(shè)計(jì)的溫度將20μL 的cDNA 以及Mix、dNTP、無(wú)酶ddH2O在PCR 儀中進(jìn)行擴(kuò)增，設(shè)定35 個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增產(chǎn)物用含溴化乙啶的瓊脂糖凝膠電泳鑒定。以GAPDH 作為內(nèi)參照。

表1 引物序列

七、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用SPSS17.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理，采用單因素方差分析，P＜0.05 為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

一、酒精和DAPT 對(duì)CYP2E1 細(xì)胞存活率的影響 CYP2E1 細(xì)胞分別經(jīng)酒精、DAPT、DAPT+酒精和空白處理后，檢測(cè)發(fā)現(xiàn)酒精處理組細(xì)胞存活率明顯低于空白組，DAPT 組較空白組略低，DAPT+酒精組細(xì)胞存活率明顯高于酒精組（P＜0.05），提示酒精對(duì)細(xì)胞有明顯的損傷作用，而DAPT 可以緩解這種作用。

二、酒精對(duì)Notch 下游蛋白NICD1 和 HES1 表達(dá)的影響 C3A 細(xì)胞和CYP2E1 細(xì)胞在無(wú)血清培養(yǎng)基中饑餓培養(yǎng)24h 后，檢測(cè)發(fā)現(xiàn)C3A 細(xì)胞NICD1 和HES1 有少量表達(dá)，加入100mM 酒精刺激24h 后，C3A 細(xì)胞 NICD1 和 HES1 表達(dá)無(wú)明顯變化，而CYP2E1 細(xì)胞 NICD1 和 HES1 表達(dá)明顯增強(qiáng)（圖1）。

圖1 C3A 和CYP2E1 細(xì)胞Notch1 及其下游靶基因HES1 的表達(dá) 經(jīng)Western blot 檢測(cè)發(fā)現(xiàn)C3A 和CYP2E1 細(xì)胞本身有少量NICD1 和HES1 表達(dá)，在加入100mM 酒精刺激24 小時(shí)后，兩者在CYP2E1 細(xì)胞表達(dá)明顯增強(qiáng)

三、酒精對(duì)細(xì)胞Notch1mRNA水平的影響 C3A細(xì)胞和CYP2E1 細(xì)胞幾乎檢測(cè)不到Notch1。在加入100mM酒精培養(yǎng)1h后，可見(jiàn)CYP2E1細(xì)胞Notch1RNA 水平顯著升高（圖2）。

圖2 C3A 和CYP2E1 細(xì)胞Notch1mRNA 水平變化 經(jīng)PCR 法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)C3A 和 CYP2E1 細(xì)胞本身有低水平的Notch1mRNA，在加入100mM 酒精刺激1 小時(shí)后，CYP2E1細(xì)胞Notch1mRNA 水平明顯增高

四、DAPT 對(duì)酒精誘導(dǎo)的細(xì)胞NICD1 和HES1變化的影響 在DAPT 預(yù)處理C3A 和CYP2E1 細(xì)胞24h 后，加入酒精刺激，結(jié)果C3A 和CYP2E1 細(xì)胞NICD1 和HES1 表達(dá)水平較未經(jīng)DAPT 預(yù)處理細(xì)胞明顯減少，表明DAPT 可以有效地抑制酒精刺激后細(xì)胞Notch 信號(hào)通路的激活（圖3）。

圖3 DAPT 對(duì) C3A 和 CYP2E1 細(xì)胞 NICD1 和 HES1 表達(dá)的影響 用 DAPT（10μM，24h）預(yù)處理兩種細(xì)胞，用Western blot 檢測(cè)NICD1 和HES1 表達(dá)。與無(wú)DAPT 處理比較，DAPT 處理的 C3A 和 CYP2E1 細(xì)胞 NICD1 和 HES1 表達(dá)明顯增強(qiáng)

討論

Pratheesh 發(fā)現(xiàn) Notch 信號(hào)通路的配體Jag-1mRNA 是酒精敏感性miRNA 中的靶基因之一，這些發(fā)現(xiàn)說(shuō)明Notch 信號(hào)通路在基因水平與生物體對(duì)酒精的敏感性相關(guān)[1～3]。在此基礎(chǔ)上，我們發(fā)現(xiàn)酒精可以在代謝過(guò)程中產(chǎn)生氧化應(yīng)激誘導(dǎo)Notch信號(hào)通路高表達(dá)，Notch 信號(hào)通路進(jìn)一步導(dǎo)致酒精性肝損傷[4～6]。Notch 受體在細(xì)胞膜被 γ 內(nèi)分泌酶切割釋放活化的胞內(nèi)域NICD1，NICD1 與細(xì)胞核的共轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合后激活其下游靶基因HES1[7，8]。因此，NICD1 和HES1 表達(dá)升高可代表Notch 信號(hào)通路的激活[9]。本實(shí)驗(yàn)以NICD1 和HES1 為檢測(cè)指標(biāo)，從蛋白水平證明了酒精代謝產(chǎn)生的氧化應(yīng)激可以上調(diào)Notch 的表達(dá)。γ 分泌酶抑制劑DAPT 是Notch 信號(hào)通路的阻斷劑，DAPT 可以有效地阻斷Notch 信號(hào)通路的活化，從而抑制NICD 的生成。本研究中證明在酒精性肝病體外模型中應(yīng)用DAPT 能有效地抑制NICD 的生成以及Notch 信號(hào)通路下游靶基因的活化[10～12]。

酒精性肝病的發(fā)病機(jī)制有很多，例如酒精的代謝產(chǎn)物乙醛對(duì)肝細(xì)胞的直接損傷，誘發(fā)氧化應(yīng)激和脂質(zhì)過(guò)氧化紊亂、內(nèi)毒素血癥和鐵沉積[13]等。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)酒精激活了Notch 信號(hào)通路，從而引起肝細(xì)胞損傷。近年來(lái)，由于Notch 信號(hào)通路在包括T 淋巴細(xì)胞白血病、胰腺癌、結(jié)腸癌等許多癌癥細(xì)胞中的表達(dá)升高[14]，關(guān)于Notch 信號(hào)通路阻斷劑的研究越來(lái)越多。已有研究表明抑制Notch 信號(hào)通路可以抑制癌癥細(xì)胞增殖，從而緩解癌癥的進(jìn)展。那么，抑制Notch 信號(hào)通路是否可以緩解酒精對(duì)肝細(xì)胞的直接損傷？我們用MTT 法證明了DAPT 預(yù)處理酒精性肝病體外模型后，酒精對(duì)肝細(xì)胞的直接損傷導(dǎo)致的肝細(xì)胞存活率下降得到了明顯的改善，表明DAPT 可以緩解酒精對(duì)肝細(xì)胞的毒性作用，其作用機(jī)制可能與Notch 信號(hào)通路的抑制有關(guān)，但尚需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證實(shí)。

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