血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2基因A9570G多態(tài)性與高血壓合并左心室肥厚的相關(guān)性研究

胡雙龍 陳文忠 李銘 李志樑 徐春生

左心室肥厚(left ventricular hypertrophy，LVH)是心血管疾病的獨(dú)立危險(xiǎn)因子，高血壓患者一旦發(fā)生LVH，其心血管事件發(fā)生率明顯增高。目前認(rèn)為在LVH的發(fā)生發(fā)展中，腎素血管緊張素醛固酮系統(tǒng)(renin-angiotensin-aldosterone system，RAAS)發(fā)揮重要作用，主要通過其效應(yīng)激素血管緊張素Ⅱ(angiotensinⅡ，AngⅡ)參與心肌重構(gòu)。血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2(angiotensin I converting enzyme 2，ACE2)是新近發(fā)現(xiàn)的活性酶［1］，是RAAS新成員，能水解AgⅡ成為血管緊張素1-7(angiotensin 1-7，Ang1-7)，參與心肌重構(gòu)、血管收縮等病理生理過程，目前認(rèn)為ACE2是心臟重要的保護(hù)因子。已有研究表明，ACE2基因的多態(tài)性可能影響血漿及局部心肌組織中ACE2的水平或活性［2］，而本研究試圖探討ACE2基因多態(tài)性與高血壓患者左心室肥厚的關(guān)系。

1 對(duì)象和方法

1.1 研究對(duì)象

選擇2007年3月至2010年10月在解放軍421醫(yī)院、廣州市南沙中心醫(yī)院、南方醫(yī)科大學(xué)附屬珠江醫(yī)院內(nèi)科門診就診及住院的無血緣關(guān)系的漢族原發(fā)性高血壓初診患者，診斷標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)《中國高血壓防治指南》2005年修訂版，即坐位收縮壓(SBP)＞140 mm Hg和(或)舒張壓(SBP)＞90 mm Hg。排除標(biāo)準(zhǔn):繼發(fā)性高血壓，近1年有充血性心力衰竭、心肌梗死病史，嚴(yán)重心律失常，合并有糖尿病、甲狀腺功能亢進(jìn)、先天性心臟病、瓣膜性疾病、心肌病、肺原性心臟病及其他研究者認(rèn)為不適宜的患者。本研究共入選325例高血壓患者，其中男性218例，女性107例，年齡32～74歲，平均(59.5 ±10.3)歲。所有患者行超聲心動(dòng)圖評(píng)估心室重構(gòu)情況，并分為高血壓合并LVH組(LVH組，172例)及高血壓未合并LVH組(NLVH組，153例)，同時(shí)于清晨6:00空腹抽取外周血2 ml，冷凍保存用于提取DNA。

健康對(duì)照組:按簡單隨機(jī)抽樣的方法選取門診健康體檢者。經(jīng)詢問病史、體格檢查、實(shí)驗(yàn)室檢查、心電圖、X線檢查排除各類心血管疾病及糖尿病。共入選80例，其中男性40例，女性40例，年齡32～70 歲，平均(50.2 ±11.3)歲。

1.2 研究方法

1.2.1 臨床資料采集 記錄患者的性別、年齡、體質(zhì)指數(shù)(BMI)、TC、TG、HDL-C、LDL-C、空腹血糖(GLU)、SBP、DBP 等。

1.2.2 超聲心動(dòng)圖檢查 采用美國Gevingmed公司system-five型彩色多普勒超聲顯像系統(tǒng)，探頭頻率2.5 MHz。測(cè)定左心室舒張末期內(nèi)徑(LVEDd)、舒張期室間隔厚度(IVST)、舒張期左心室后壁厚度(LVPWT)。計(jì)算左心室心肌質(zhì)量(LVM)=0.8×1.04［(LVPWT+LVEDd+IVST)×3-LVEDd × 3］+0.6;左心室質(zhì)量指數(shù)(LVMI)=LVM/體表面積(BSA)(g/m2)。左心室肥厚診斷標(biāo)準(zhǔn)采用Echo標(biāo)準(zhǔn):LVMI:男≥112 g/m2，女≥104 g/m2。

1.2.3 DNA提取、擴(kuò)增 采用Tiangen公司提供的外周血基因組DNA提取試劑盒提取DNA，紫外分光光度計(jì)測(cè)定DNA濃度，并標(biāo)化DNA濃度值至20 mg/L，溶于TE中，-80℃凍存。DNA擴(kuò)增采用25 μl反應(yīng)體系，反應(yīng)體系包括:10×buffer(含Mg2+)2 μl，10 μmol/L 上、下游引物各 0.5 μl，10 mmol/L 三磷酸脫氧核苷 1.6 μl，基因組 DNA 20 ng，5 U/L Taq DNA 聚合酶 0.2 μl，消毒雙蒸水 19.2 μl。PCR 反應(yīng)條件為:94℃預(yù)變性 1 min，94℃變性 40 s，58.5℃退火 30 s，72℃延伸 30 s，32 個(gè)循環(huán)，72℃ 延伸加時(shí)7 min以終止所有反應(yīng)。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證。

1.2.4 ACE2基因多態(tài)性檢測(cè) 采用限制性片段長度多態(tài)性(restriction fragment length polymorphism，RFLP)的方法進(jìn)行基因分型。上游引物序列為:5'-CATGTGGTCAAAAGGATATCT-3'，下游引物序列為:5'-AAAGTAAGGTTGGCAGACAT-3'。由北京三博遠(yuǎn)志技術(shù)有限責(zé)任公司合成引物。酶切反應(yīng)體系20 μl，包括特異性 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物8 μl，AluⅠ酶1 U，10 ×buffer(AluⅠ酶自帶)2 μl，消毒雙蒸水 9 μl。酶切溫度:37℃，酶切時(shí)間:16 h。酶切產(chǎn)物點(diǎn)樣于2%瓊脂糖凝膠，以50 bp ladder標(biāo)志作為判斷DNA片段大小的標(biāo)準(zhǔn)物，100 V電泳35 min，在紫外燈下觀察電泳條帶以鑒定基因型。對(duì)各基因型隨機(jī)抽樣測(cè)序(Invitrogen生物技術(shù)有限公司)核實(shí)基因型。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 ACE2基因型酶切電泳結(jié)果

A基因型的PCR產(chǎn)物被酶切成281 bp和185 bp兩個(gè)片段，G基因型的產(chǎn)物不能被酶切，電泳時(shí)僅有1個(gè)片段，長度為466 bp，而G/A雜合子表現(xiàn)為同時(shí)具有3個(gè)條帶(圖1)。

圖1 酶切電泳條帶

2.2 3組間臨床資料比較

無論是男性還是女性，NLVH組和LVH組的SBP和DBP均高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P＜0.05)，而NLVH組和LVH組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P＞0.05)。3 組間年齡、BMI、GLU、TG、TC、HDL-C和 LDL-C比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P＞0.05)，見表1。

2.3 3組間基因型分布和等位基因頻率的比較

由于ACE2位于X染色體，僅對(duì)女性進(jìn)行遺傳平衡吻合度檢驗(yàn)，結(jié)果符合Hardy-Weinberg平衡(χ2=0.076，P＞ 0.05)，表明樣本的代表性好。按性別進(jìn)行分類分析，在女性，3組間等位基因頻率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=9.970，P=0.007)，基因型分布差異也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=10.387，P=0.034)，LVH組GG基因型及G等位基因頻率高于NLVH組及對(duì)照組。在男性，3組間等位基因/基因型頻率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=12.742，P=0.002)，LVH組 G基因型/等位基因頻率高于NLVH組及對(duì)照組，見表2。

表1 3組間臨床資料比較

表2 3組間ACE2基因型分布和等位基因頻率的比較［例(%)］

3 討論

在新的RAAS體系中，ACE2可直接降解AngⅡ使其轉(zhuǎn)變?yōu)?Ang1-7［3］，也可通過水解 Ang I生成Ang1-9，進(jìn)而生成 Ang1-7［4］。Ang1-7 功能與 AngⅡ相反，表現(xiàn)為舒張血管、抗心血管增殖及抗纖維化形成［5-7］。通過調(diào)控血管緊張素的生成與平衡，ACE2對(duì)延緩心肌肥厚、心肌纖維化的形成發(fā)揮積極作用［8］。研究表明，在自發(fā)性高血壓大鼠(spontaneous hypertensive rats，SHR)體內(nèi)，ACE2的表達(dá)增加可以延緩SHR心肌結(jié)構(gòu)損傷［9］。而在ACE2基因敲除小鼠體內(nèi)AngⅡ水平升高，缺氧誘導(dǎo)基因表達(dá)上調(diào)以及心臟結(jié)構(gòu)功能嚴(yán)重受損［10］。研究證實(shí)，利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)使SHR體內(nèi)ACE2過表達(dá)，通過抑制心肌和血管周圍的纖維化，最終延緩高血壓心血管重構(gòu)的發(fā)生發(fā)展［11］。ACE2的過度表達(dá)可預(yù)防SHR的病理性心肌肥厚、心肌和血管周圍纖維化，降低其血壓，同時(shí)還降低了其心肌梗死面積，改善心肌梗死的血流動(dòng)力學(xué)［12］。

本研究探討了ACE2基因A9570G多態(tài)性與高血壓左心室肥厚的關(guān)系，結(jié)果表明，在女性，LVH組GG基因型及G等位基因頻率均高于NLVH組及對(duì)照組。在男性，LVH組G基因型/等位基因頻率也高于NLVH組及對(duì)照組，提示ACE2基因A9570G多態(tài)性與高血壓患者左心室重構(gòu)相關(guān)，ACE2基因A9570G多態(tài)性可能是影響高血壓患者發(fā)生左心室重構(gòu)的遺傳因素，G等位基因可能是其易感基因，檢測(cè)ACE2基因A9570G多態(tài)性有助于高血壓患者預(yù)后的判斷。ACE2基因A9570G多態(tài)性如何影響高血壓左心室重構(gòu)的發(fā)生發(fā)展目前尚不完全清楚，分子生物學(xué)研究已經(jīng)明確ACE2基因定位于Xp22［13］，有18個(gè)外顯子，迄今已知人類該基因的SNP位點(diǎn)有140個(gè)，絕大多數(shù)位于非編碼的內(nèi)含子區(qū)域，而本研究中的SNP位點(diǎn)A9570G位于第三內(nèi)含子，緊靠外顯子的位置，已有研究表明這個(gè)位點(diǎn)可以改變mRNA的剪接［14］，那么其改變就可能對(duì)基因的功能產(chǎn)生影響，而不僅僅是一個(gè)遺傳標(biāo)記。該位點(diǎn)的突變可能使其活性或表達(dá)增加，使ACE2更有效地降解AngⅡ，從而Angl-7生成增多。Ang1-7可明顯降低體外心肌培養(yǎng)細(xì)胞中細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1/2(ERK1/ERK2)絲裂原活化蛋白激酶的活性，并通過激活Mas受體抑制心肌細(xì)胞增長，減輕心室功能紊亂和心室重構(gòu)［15］。因此，我們推測(cè)ACE2基因多態(tài)性可能通過影響ACE2的表達(dá)或活性，進(jìn)而調(diào)節(jié)Angl-7，參與高血壓左心室重構(gòu)的發(fā)生發(fā)展。深入探討ACE2基因多態(tài)性與高血壓左心室肥厚的關(guān)系，進(jìn)一步揭示其對(duì)ACE2基因表達(dá)和功能的影響，將有助于闡明其發(fā)病機(jī)制，并為臨床診治提供新的思路。

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