血清可替寧水平與冠心病的關(guān)系

楊睿悅 劉君萌 何青 國漢邦 李紅霞 王抒 董軍 陳文祥

流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，吸煙是冠心病(coronary artery disease，CAD)等心血管疾病的重要危險因素。這些研究多通過調(diào)查每日吸煙支數(shù)的方法對吸煙暴露水平進行評價，容易引入偏倚，而且這種調(diào)查報告的方法也無法很好地評價被動吸煙的暴露水平［1］。近年來，有研究開始用生物樣本中可替寧(cotinine)水平來評價吸煙暴露水平，精密性和客觀性明顯提高［2-4］?？商鎸幉⒎菬煵葜械墓逃谐煞郑菬煵葜械闹饕煞帜峁哦?nicotine)在體內(nèi)代謝的主要產(chǎn)物，它的生物半衰期為18～22 h，較尼古丁延長了約20 h，能反映人體3～4 d的暴露情況，是一種可靠的、具有潛在應(yīng)用價值的生物學(xué)標(biāo)志物［2］。本研究通過分析和比較經(jīng)冠狀動脈造影證實為CAD和非CAD者的血清可替寧水平，探討其與CAD及其他危險因素間的關(guān)系，旨在為其臨床應(yīng)用提供進一步的理論依據(jù)。

1 對象和方法

1.1 對象

連續(xù)錄取2009年5月至2010年3月于衛(wèi)生部北京醫(yī)院心內(nèi)科住院并行冠狀動脈造影的患者149例。根據(jù)冠狀動脈造影結(jié)果分為CAD組與非CAD組。CAD組97例，年齡39～83歲，平均(65.0±10.8)歲;非 CAD組52例，年齡34～84歲，平均(61.5±11.2)歲。冠狀動脈造影采用Judkins法，應(yīng)用常規(guī)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)行冠狀動脈造影。CAD患者定義為冠狀動脈造影顯示左前降支、左回旋支、右冠狀動脈及其主要分支中至少有一支血管管腔狹窄程度≥50%。非CAD患者定義為上述血管管腔狹窄程度均＜50%。有下列情況者予以剔除:(1)近6個月內(nèi)服用過他汀類降脂藥物(查閱病史記錄及詢問用藥史);(2)近1個月內(nèi)發(fā)生急性心肌梗死;(3)臨床資料獲取有困難者。收集吸煙、高血壓、糖尿病、腦血管病、血脂異常和心血管病家族史(一級親屬患CAD或腦卒中)等資料，并測定血壓，計算脈壓和平均動脈壓，計算體質(zhì)指數(shù)(BMI)，BMI=體重/身高2(kg/m2)。吸煙者為每日吸煙≥1支、時間≥1年者;不吸煙者為平時不吸煙或戒煙＞1年者。本研究通過衛(wèi)生部北京醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，研究對象均簽署了知情同意書。

1.2 方法

所有研究對象均采集清晨空腹靜脈血標(biāo)本，分離血清后分裝，－80℃冰凍保存待檢。測定時將血清樣品融化并使之恢復(fù)到室溫，搖勻?？商鎸幉捎猛凰叵♂屢合嗌V串聯(lián)質(zhì)譜法(isotope dilution tandem mass spectrometry，ID-LC/MS/MS)測定［5］。0.1 ml不同濃度的可替寧標(biāo)準(zhǔn)溶液或血清樣品，加5 μg/L的D3-可替寧內(nèi)標(biāo)溶液0.1 ml，渦旋10 s;加0.5 ml乙腈，渦旋30 s，4℃ 3148×g離心15 min;吸取上清液0.2 ml置進樣瓶中，室溫下氮氣吹干，流動相重組。液相分離后進入串聯(lián)質(zhì)譜分析;質(zhì)譜采用多離子反應(yīng)監(jiān)測(multiple reaction monitoring，MRM)模式，可替寧和內(nèi)標(biāo)離子通道分別選擇為質(zhì)荷比(mass to charge，m/z)177→80和m/z 180→80;以標(biāo)準(zhǔn)溶液可替寧濃度為X軸，可替寧和內(nèi)標(biāo)峰面積的比值為Y軸，進行線性回歸分析，計算血清樣品可替寧濃度。

Aemset abbott全自動生化分析儀(雅培公司，美國)測定空腹血糖(FBG)等血生化指標(biāo)。Sysmex 2100全自動血細(xì)胞分析儀(東亞公司，日本)測定血常規(guī)。酶法測定血清TC、TG;超速離心高效液相色譜法［6］測定 LDL-C、HDL-C 和脂蛋白亞類 LDLa-C、LDLb-C、HDL2-C、HDL3-C;超敏 C反應(yīng)蛋白(hs-CRP)測定采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)采用SPSS 16.0軟件包進行統(tǒng)計分析，主要指標(biāo)均進行正態(tài)性檢驗;計量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，多組間比較采用方差分析，各組間均值兩兩比較采用LSD-t檢驗;計數(shù)資料采用百分構(gòu)成比表示，組間比較采用卡方檢驗;血清可替寧數(shù)據(jù)呈偏態(tài)分布，用中位數(shù)(四分位數(shù))表示，變量轉(zhuǎn)換后仍未達(dá)正態(tài)，用非參數(shù)Mann-Whitney U檢驗比較組間差異;多因素Logistic回歸分析采用進入法，最大似然比檢驗;相關(guān)性采用非參數(shù)Spearman相關(guān)性分析。以雙側(cè)P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 可替寧分布和基線情況

149 例行冠狀動脈造影的患者血清可替寧濃度呈偏態(tài)和尖態(tài)分布(偏度2.90，峰度7.96)，其中61例吸煙者的可替寧濃度為12.64(0.91～99.61)μg/L，顯著高于88例非吸煙者的濃度［0.22(0.12～0.51)μg/L，P＜0.001］。按照血清可替寧水平將吸煙暴露水平分為3層，即＞10.00 μg/L的32例、1.00～10.00 μg/L 的18 例以及 ＜1.00 μg/L 的 99例;與低水平可替寧組比較，高水平可替寧組的男性比例和白細(xì)胞計數(shù)(WBC)水平顯著升高(均為P＜0.05)，HDL-C和 HDL2-C顯著降低(均為P＜0.05);其余指標(biāo)3組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(均為P＞0.05)，見表1。

表1 149例冠狀動脈造影患者基線資料

2.2 可替寧與CAD的關(guān)系

CAD組與對照組吸煙狀況、可替寧水平比較見表2。吸煙者與非吸煙者相比，OR值為2.22(95%CI:1.08～4.57，P＜0.05)。高、中可替寧水平組與低可替寧水平組比較，OR值分別為2.94(95%CI:1.11～7.78，P＜0.05)和 1.36(95%CI:0.47～3.43，P＞0.05)，且隨著血清可替寧水平的升高，OR值增大呈量效關(guān)系，卡方趨勢檢驗值為5.01，P=0.027。提示吸煙、高血清可替寧水平可能增加CAD的發(fā)病風(fēng)險。

2.3 CAD影響因素的Logistic回歸分析

將性別、年齡、可替寧水平、BMI、糖尿病、高血壓、血脂異常(入院后首次血脂檢查結(jié)果為TC＞5.7 mmol/L或TG ＞1.7 mmol/L或LDL-C ＞3.6 mmol/L或HDL-C＜0.91 mmol/L者)作為自變量，是否患有CAD為因變量，進行Logistic回歸分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)糖尿病、可替寧水平及血脂異常是CAD的獨立影響因素，見表3。

表2 吸煙、血清可替寧水平與CAD的關(guān)系

表3 CAD影響因素的Logistic回歸分析

2.4 可替寧與其他指標(biāo)的相關(guān)性

血清可替寧水平與吸煙、WBC呈顯著正相關(guān)(P＜0.05)，與 HDL-C和 HDL2-C呈顯著負(fù)相關(guān)(P＜0.05)?？商鎸幣c大顆粒的HDL2-C的相關(guān)系數(shù)(r=－0.217)較與HDL的(r=－0.184)更高，提示其與脂蛋白亞類的顆粒大小關(guān)系可能更為密切。可替寧對其他指標(biāo)無顯著影響(P＞0.05)，見表4。

表4 可替寧與其他指標(biāo)的相關(guān)性

3 討論

研究顯示，吸煙與被動吸煙可增加CAD等多種疾病的發(fā)病風(fēng)險。相比于調(diào)查問卷的方法，吸煙與心血管病等疾病的關(guān)系需要更加客觀、準(zhǔn)確的評價方法。隨著近年液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(LC/MS/MS)分析技術(shù)的成熟，也迅速應(yīng)用于反映吸煙暴露水平的生物學(xué)標(biāo)志物可替寧的檢測以及暴露與疾病發(fā)生危險的分析中［4，7-8］，如美國疾病控制中心開展的第三次全國健康與營養(yǎng)狀況調(diào)查(NHANESⅢ)就用LC/MS/MS檢測了數(shù)萬人群體內(nèi)可替寧與心血管疾病的關(guān)系［4］，但在我國相關(guān)研究還較少。此外，這些方法在樣品預(yù)處理中大多采用液液萃取或固相萃取，提取過程繁瑣、費時、成本較高。我們在之前的研究中建立了一種樣品處理簡便(僅需沉淀蛋白)、靈敏、準(zhǔn)確的ID-LC/MS/MS測定人血清可替寧的方法，能夠適用于大規(guī)模的臨床和流行病學(xué)研究［5］。本研究利用此方法對CAD和非CAD患者的血清可替寧水平進行測定，并探討了其與CAD及其他危險因素之間的關(guān)系。

文獻報道絕大多數(shù)吸煙者血清中可替寧水平在10～400 μg/L;非吸煙者暴露于嚴(yán)重污染的煙草煙霧環(huán)境下，其水平在1～10 μg/L;而暴露于一般的煙草煙霧環(huán)境下其水平多低于1 μg/L［8-9］。本研究測定149例冠狀動脈造影患者血清中可替寧水平發(fā)現(xiàn)，吸煙者和非吸煙者的可替寧水平與文獻報道的濃度范圍基本一致，吸煙者的可替寧水平顯著高于非吸煙者(P＜0.001)，可替寧濃度與吸煙狀況呈顯著正相關(guān)(P＜0.001)，表明血清可替寧濃度能夠有效地反映吸煙狀況。故按照上述可替寧水平將吸煙暴露水平分為3層，進行分析。結(jié)果顯示，吸煙者患CAD的危險是非吸煙者的2.22倍(P＜0.05)，高可替寧水平組患CAD的OR值更高(是低水平組的2.94倍，P＜0.05)，且隨著可替寧水平的增加，OR值增大呈量效關(guān)系。在可替寧及其他常見危險因素(肥胖、糖尿病、高血壓、血脂異常)與CAD的多因素回歸分析顯示，糖尿病、血脂異常及可替寧為最顯著的危險因素。由此可見，血清可替寧水平增加，患CAD的危險增加，高水平可替寧是CAD的獨立危險因素。但對之前基于大規(guī)模人群研究報道的性別、年齡、肥胖和高血壓是CAD的獨立危險因素在本研究中并未顯現(xiàn)，可能與樣本量較少以及對照組的選擇有關(guān)。本研究對照組選擇了因不典型性胸痛而入院擬行冠狀動脈造影的患者，他們中大部分都或多或少具有CAD危險因素，而不是真正的陰性對照組，對結(jié)果的分析造成了一定影響。

吸煙通過多種途徑增加CAD的發(fā)病風(fēng)險，其中影響脂代謝是其主要機制之一。已有研究表明，吸煙以及可替寧水平升高，與血清HDL-C水平降低有關(guān)［10］。目前尚缺乏可替寧與脂蛋白亞類關(guān)系的研究。HDL-C降低是CAD的重要危險因素，最近研究證實HDL中對動脈粥樣硬化有保護作用的是較大顆粒的 HDL2，而小顆粒 HDL3則無保護作用［11］。本研究首次對可替寧與脂蛋白亞類的相關(guān)性進行了分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)血清可替寧與HDL-C和HDL2-C呈顯著負(fù)相關(guān)，對TC、TG、LDL-C及其亞類并無顯著影響?？商鎸幩皆礁撸琀DL-C和大顆粒的HDL2-C越低，對心血管保護作用越弱，從而加速動脈粥樣硬化進程，具體機制尚需進一步研究。

吸煙還可通過炎癥機制促進動脈粥樣硬化疾病的發(fā)生發(fā)展，顯著升高吸煙者WBC和CRP等炎癥標(biāo)志物的水平，從而增加心血管病發(fā)病危險［12-13］。而戒煙可使升高的炎癥細(xì)胞和炎癥因子水平隨戒煙時間延長而進行性降低，并與心血管病危險的下降趨勢一致［14］。本研究顯示，血清可替寧水平與WBC呈顯著正相關(guān)，但對hs-CRP無顯著影響，可能是受到樣本例數(shù)的限制，未顯現(xiàn)出統(tǒng)計學(xué)意義。

總之，血清可替寧作為一個客觀的生物學(xué)標(biāo)志物指標(biāo)，能夠更有效地反映吸煙的暴露水平，具有更可靠的CAD的危險預(yù)示能力，有望在吸煙與CAD及其他疾病關(guān)系等研究中發(fā)揮重要作用。

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