茶多酚抑制人血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌單核細(xì)胞趨化蛋白1的研究

陳北冬 沈恂 齊若梅

動(dòng)脈粥樣硬化是一種以血脂紊亂作為病理基礎(chǔ)，并伴有血管細(xì)胞氧化應(yīng)激的慢性炎癥性疾病。單核細(xì)胞趨化蛋白1(monocytechemotactic protein-1，MCP-1)參與白細(xì)胞的招募，是動(dòng)脈粥樣硬化重要的始動(dòng)因子，在動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展中起到重要的作用［1-2］。

綠茶的主要有益成分是茶多酚(tea polyphenols)，大量實(shí)驗(yàn)證明茶多酚具有抗氧化、抗脂質(zhì)過氧化、清除自由基、抗突變和抗腫瘤形成等藥理效應(yīng)。但是其對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化影響的研究還很少，尤其是有關(guān)茶多酚對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌MCP-1的調(diào)節(jié)作用尚未見報(bào)道。本研究觀察了茶多酚對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞炎癥蛋白MCP-1的影響，并以水溶性的維生素E(Trolox)和銀杏標(biāo)準(zhǔn)提取物(EGb761)為抗氧化劑對(duì)照，評(píng)價(jià)茶多酚對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 內(nèi)皮細(xì)胞 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞系EA.hy926，由University of North Carolina的C.J.Edgell教授饋贈(zèng)。由原代人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)與人肺Ⅱ型上皮細(xì)胞系(A549)雜交而成。

1.1.2 藥物與試劑 茶多酚為中國(guó)科學(xué)院生物物理研究所腦與認(rèn)知國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供，為色譜純。Trolox及MTT購自美國(guó)Sigma公司。EGb761購自德國(guó)威瑪舒培博士藥廠。鼠抗人單抗及生物素標(biāo)記羊抗人MCP-1單抗，購自美國(guó)R＆D Systems公司。重組人 MCP-1標(biāo)準(zhǔn)品購自英國(guó) Peprotech公司。pMCP-1全長(zhǎng)報(bào)告基因質(zhì)粒由Dr.Remick(Department of Pathology，University of Michigan Medical School)饋贈(zèng)。轉(zhuǎn)染試劑VigoFect購自威格拉斯生物技術(shù)(北京)公司。

1.1.3 儀器 奧林巴斯顯微鏡;美國(guó)芬蘭雷勃MK3酶標(biāo)儀;Glo MaxTM96微孔板發(fā)光檢測(cè)儀。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與處理 EA.hy926細(xì)胞用含有2 mmol/L谷氨酰胺、100 U/ml青霉素、100 μg/ml鏈霉素和10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基在37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。于實(shí)驗(yàn)前24 h，將細(xì)胞計(jì)數(shù)后，接種到6孔培養(yǎng)板或24孔板中培養(yǎng)，加藥前用無血清的DMEM洗細(xì)胞2次，氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)刺激前用含有0.2%血清的DMEM饑餓細(xì)胞12～24 h。

1.2.2 MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力 氧化型MTT進(jìn)入細(xì)胞后被線粒體脫氫酶還原生成藍(lán)色Formazan顆粒，經(jīng)DMSO溶劑溶解后比色定量，其顏色深淺直接與細(xì)胞活力有關(guān)。用MTT法檢測(cè)亞硒酸鈉對(duì)EA.hy926細(xì)胞的毒性。

1.2.3 酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測(cè)定MCP-1 采用ELISA測(cè)定內(nèi)皮細(xì)胞分泌到培養(yǎng)上清中的MCP-1含量。用酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度值，計(jì)算MCP-1含量。

1.2.4 用熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)檢測(cè)MCP-1的轉(zhuǎn)錄活性 將依賴于MCP-1的熒光素酶報(bào)告基因用轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染到EA.hy926細(xì)胞中，24～36 h后裂解細(xì)胞吸取上清，檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的熒光素酶的活性，間接地反映出MCP-1的轉(zhuǎn)錄活性。

1.3 分組與處理

對(duì)照組為未刺激細(xì)胞(ox-LDL濃度為0 mg/L)，用不同濃度的 ox-LDL(20，50，100，200 mg/L)刺激EA.hy926細(xì)胞17 h后檢測(cè)MCP-1濃度值。

用MCP-1 whole promoter-luc Reporter質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染細(xì)胞24 h后，分別加入相應(yīng)的試劑(100 mg/L ox-LDL，2 μmol/L H2O2，500 μmol/L Trolox，200 μmol/L茶多酚和50 mg/L EGb761)培養(yǎng)細(xì)胞12 h，檢測(cè)報(bào)告基因的相對(duì)活性。分別用 Trolox(500 μmol/L)，不 同 濃 度 的 茶 多 酚 (50，100，200 μmol/L)和 EGb761(10，20，50 mg/L)預(yù)處理1 h后，除對(duì)照組外各組加入ox-LDL(100 mg/L)刺激12 h。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 ox-LDL誘導(dǎo)MCP-1分泌增加

用不同濃度的 ox-LDL(20，50，100，200 mg/L)孵育EA.hy926細(xì)胞17 h，收集培養(yǎng)基的上清，檢測(cè)EA.hy926細(xì)胞分泌的MCP-1。Ox-LDL刺激前，細(xì)胞均被含有0.2%FBS的DMEM培養(yǎng)基饑餓12 h，ox-LDL可以劑量依賴地上調(diào)內(nèi)皮細(xì)胞MCP-1的分泌，并且在ox-LDL濃度≥100 mg/L時(shí)這種作用更為顯著(圖1)。

2.2 茶多酚對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞活力的影響

在ox-LDL濃度≤100 mg/L時(shí)細(xì)胞活力沒有明顯改變，而當(dāng)ox-LDL濃度增加到200 mg/L時(shí)，細(xì)胞的死亡明顯增加，如圖2A所示。提示在以后的實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用濃度≤100 mg/L的ox-LDL，作用24 h以內(nèi)，不會(huì)引起明顯的內(nèi)皮細(xì)胞毒性。不同濃度茶多酚對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞活性的影響如圖2B所示，發(fā)現(xiàn)用200 μmol/L以下濃度的茶多酚孵育細(xì)胞24 h以內(nèi)不會(huì)引起明顯的內(nèi)皮細(xì)胞毒性。

2.3 茶多酚可以顯著下調(diào)人血管內(nèi)皮細(xì)胞MCP-1的分泌表達(dá)

首先以不同劑量的茶多酚處理細(xì)胞6 h和12 h，收集細(xì)胞培養(yǎng)液上清，用ELISA檢測(cè)MCP-1的表達(dá)，結(jié)果如圖3所示。發(fā)現(xiàn)在這兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)，茶多酚呈劑量依賴性減少 MCP-1的分泌，其中100 μmol/L和 200 μmol/L 茶多酚對(duì) MCP-1 表達(dá)具有顯著的抑制作用。

2.4 茶多酚顯著抑制ox-LDL誘導(dǎo)的MCP-1分泌增加

圖3 茶多酚呈濃度依賴性地減少內(nèi)皮細(xì)胞MCP-1的表達(dá)

圖4 和其他抗氧化劑相比較，茶多酚可以顯著下調(diào)MCP-1的表達(dá)

為了檢測(cè)茶多酚在轉(zhuǎn)錄水平對(duì)MCP-1的調(diào)控，我們用含有全長(zhǎng)MCP-1啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)(whole promoter-luc reporter)，以報(bào)告基因的方法進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果如圖4A所示，氧化劑H2O2(2μmol/L)作為陽性對(duì)照和 ox-LDL(100 mg/L)一樣可以明顯上調(diào)MCP-1啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的熒光素酶報(bào)告基因的表達(dá)，而抗氧化劑組里茶多酚對(duì)MCP-1的抑制具有顯著性。同時(shí)，我們還觀察了另外兩個(gè)抗氧化劑維生素E和銀杏提取物EGb761對(duì)MCP-1基因調(diào)控的影響，發(fā)現(xiàn)在對(duì)MCP-1基因調(diào)控上維生素E和銀杏提取物EGb761也能下調(diào)MCP-1(圖4A)。進(jìn)一步比較了茶多酚與維生素E和銀杏提取物EGb761對(duì)MCP-1蛋白水平的影響。ELISA結(jié)果顯示，茶多酚可以呈劑量依賴性地降低MCP-1的蛋白分泌。維生素E也能減少ox-LDL刺激產(chǎn)生的MCP-1，而銀杏提取物EGb761對(duì)ox-LDL誘導(dǎo)的內(nèi)皮MCP-1蛋白增加無明顯抑制效果(圖4B)。

3 討論

動(dòng)脈粥樣硬化所致的心腦血管疾病是嚴(yán)重危害人類生命健康的疾病之一，研究發(fā)現(xiàn)氧化修飾的低密度脂蛋白是引起動(dòng)脈粥樣硬化的重要危險(xiǎn)因素［3］。MCP-1是動(dòng)脈粥樣硬化重要的始動(dòng)因子，在早期趨化招募炎癥細(xì)胞的過程中起到非常重要的作用［4］。有文獻(xiàn)報(bào)道，MCP-1基因或者其受體CCR2基因缺陷的小鼠不形成動(dòng)脈粥樣硬化的斑塊［5］。因此，抑制MCP-1的分泌和表達(dá)是十分有意義的。我們先前的工作已經(jīng)證明ox-LDL可以上調(diào)血管內(nèi)皮細(xì)胞的 MCP-1表達(dá)［6］，本研究以 ox-LDL為刺激劑誘導(dǎo)EA.hy926內(nèi)皮細(xì)胞MCP-1的分泌增加，在基因和蛋白水平觀察茶多酚預(yù)處理對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞分泌MCP-1的影響。

茶多酚是大家公認(rèn)的抗氧化劑，具有很強(qiáng)的清除活細(xì)胞產(chǎn)生的氧自由基的能力。近年來的研究顯示茶多酚的藥用價(jià)值體現(xiàn)在多個(gè)方面，包括延緩衰老，防癌、抗癌，抑菌抗病毒，防輻射損傷［7-8］及保護(hù)腦神經(jīng)防止帕金森病損傷［9］等。目前有關(guān)茶多酚抗動(dòng)脈粥樣硬化報(bào)道僅限于在動(dòng)物的整體水平上給予高脂喂養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)同時(shí)給予茶多酚干預(yù)的兔子血清中的抗氧化酶活性增加［10］以及血漿中膽固醇的相對(duì)降低［11］。新近有文獻(xiàn)報(bào)道，富含維生素D、抗氧化維生素及多酚類的飲食模式能夠改善人血管內(nèi)皮的功能［12］，但在細(xì)胞水平研究茶多酚抗動(dòng)脈粥樣硬化機(jī)制的工作還未見報(bào)道。本研究結(jié)果顯示，茶多酚能夠在基礎(chǔ)和ox-LDL刺激的條件下抑制人血管內(nèi)皮細(xì)胞中趨化因子MCP-1的分泌表達(dá)，進(jìn)而在起始環(huán)節(jié)阻斷動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展。本研究結(jié)果還提示與其他抗氧化劑(Trolox，EGb761)相比，茶多酚可以在基因轉(zhuǎn)錄水平及蛋白表達(dá)水平顯著地呈劑量依賴地抑制ox-LDL誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞MCP-1的分泌表達(dá)。提示茶多酚的這種抑制炎癥的機(jī)制除了與其抗氧化性相關(guān)外，也許還有其他的作用通路。

本研究中還存在一些需要進(jìn)一步探討的問題。有文獻(xiàn)報(bào)道茶多酚處理細(xì)胞能夠引起細(xì)胞的凋亡［13］，但本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示茶多酚(≤200 μmol/L)不僅不會(huì)引起細(xì)胞死亡，而且還具有一定的增殖作用。我們認(rèn)為這種現(xiàn)象首先與我們使用的小劑量相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)中使用的茶多酚最大劑量是200 μmol/L，相當(dāng)于56.3 mg/L，是很小的劑量。而文獻(xiàn)報(bào)道具有增殖抑制的茶多酚濃度大都在100 mg/L以上，處理時(shí)間大于24 h。另外，本研究所用細(xì)胞系是由原代HUVEC，與人肺Ⅱ型上皮細(xì)胞系(A549)雜交而成，具有HUVEC的特性。武紅莉和陳信義［14］的研究顯示，在HUVEC中茶多酚60 mg/L組對(duì)HUVEC的抑制率為負(fù)數(shù)，其A值略大于其對(duì)照組A值，提示低濃度的茶多酚對(duì)HUVEC可能具有一定的促增殖作用，而高濃度的茶多酚對(duì)HUVEC生長(zhǎng)具有明顯的抑制作用。其研究結(jié)果與本研究結(jié)果相符，但茶多酚低濃度具有增殖作用機(jī)制尚待進(jìn)一步研究。本研究還發(fā)現(xiàn)茶多酚對(duì)生理?xiàng)l件下的MCP-1有劑量依賴的抑制作用，這可能是因?yàn)椴瓒喾蛹捌渲饕煞諩GCG在體內(nèi)或者體外都能夠抑制NF-κB的活性［15］，而 NF-κB 是調(diào)控 MCP-1 表達(dá)的重要轉(zhuǎn)錄因子。由于本實(shí)驗(yàn)研究是建立在細(xì)胞水平上的，對(duì)于更為復(fù)雜的整體水平生理功能的研究還需要進(jìn)一步完善。

本研究的實(shí)驗(yàn)結(jié)果為進(jìn)一步研究茶多酚的藥理作用及動(dòng)脈粥樣硬化的預(yù)防和治療提供了新的線索。

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