瘦素受體基因多態(tài)性與急性胰腺炎的相關(guān)性

郭繼文 李德強

瘦素(leptin)為肥胖(OB)基因的表達產(chǎn)物，是一種由167個氨基酸組成的分泌性蛋白質(zhì)類激素，主要由脂肪細胞分泌。研究發(fā)現(xiàn)，瘦素與急性胰腺炎(AP)之間有密切關(guān)系，瘦素通過作用于瘦素受體(LEPR)而發(fā)揮作用。本研究運用多聚酶鏈反應一限制性片段長度多態(tài)性(PCR-RFLP)技術(shù)檢測LEPR A668 g位點和G3057A位點基因多態(tài)性，探討LEPR基因多態(tài)性與AP的關(guān)系，為AP的防治提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 本組患者46例，其中男27例，女19例，年齡18～75歲，平均53.7歲。其中胰管狹窄、胰管結(jié)石者11例，膽道感染及膽石癥23例，暴飲暴食者7例，不明原因者5例?；颊吲R床癥狀有不同程度的腹痛，呈絞痛、刀割樣痛或鈍痛;發(fā)熱23例，平均體溫為38.6℃;伴有不同程度腹脹、惡心、嘔吐者32例;并發(fā)低鉀血癥29例;重癥急性胰腺炎1例，有反跳痛及腹肌緊張表現(xiàn)，全腹有明顯壓痛，伴有血性腹水，可觸及明顯壓塊。所有患者均經(jīng)B超、腹部平片、血淀粉酶檢查明確診斷。對照組45例為同期體檢科正常體檢者。兩組間一般情況比較見表1，兩組間TC、TG及血糖水平差異有統(tǒng)計學意義。

1.2 方法

1.2.1 LEPR基因檢測方法 ①DNA提取:取入組者外周血0.5 ml，2%EDTA抗凝，按Axygen試劑盒說明提取DNA。②LEPR 引物設(shè)計:參照文獻［1］:5'-ACCCTTTAAGCTGGGTGTCCCAATAG-3';5'-GCTAGCAAATATTTTTGTAAGCAATT-3”。③PCR 擴增:PCR 反應體系體積為 30 μl，2 μl DNA，2 mmol/L NTP 2 μl，引物 P1 40 pmol/L，引物 P2 40 pmol/L，10 × PCR 緩沖液3ul，2.5U Taq聚合酶。PCR反應條件:94℃預變性5 min，94℃ 50s，61℃ 60s，72℃ 90s，共 35 個循環(huán)。④RFLP 分析:A668 g、G3057A內(nèi)切酶消化產(chǎn)物:取22 μl PCR產(chǎn)物，10×Buffer3 ul，H2O 1.5 μl，內(nèi)切酶10U，37℃水浴過夜;取 20 ul酶切產(chǎn)物加入瓊脂糖凝膠負極端的加樣孔，以溴酚藍為指示劑，溴化乙錠為染色劑，在150伏電壓下電泳30 min，在300 mm紫外線燈下觀察帶型。A668 g位點共有3種基因型:GG為純合子突變型(300bp、140bp)，GA 為雜合子(440bp、300 bp、140bp)，AA為純合子野生型(440 bp);G3057A位點也有3種基因型:AA為純合子突變型(253bp)，GA為雜合子(253bp、221bp、32bp)，GG 為純合子野生型(32bp、221bp)。

1.2.2 統(tǒng)計學方法 應用統(tǒng)計SPSS 13.0軟件，基因型和等位基因頻率采用基因計數(shù)法，組間率的比較用R×C表χ2檢驗。

2 結(jié)果

2.1 LEPR基因多態(tài)性結(jié)果兩組間基因型GG、GA、AA的觀察值和期望值Hardy-Weinberg平衡吻合度良好(P＞0.05)，符合Hardy-Weinberg平衡定律，提示個體間無血緣關(guān)系。

2.2 兩組A668 g、G3057A基因型及等位基因分布頻率見表2。A668 g、G3057A基因型及A668 g等位基因頻率在AP組和對照組間差異無統(tǒng)計學意義;G3057A等位基因A在對照組的分布頻率低于AP組，差異有統(tǒng)計學意義。

2.3 LEPR基因型對血脂水平的影響LEPR A668 g位AG基因型攜帶者與GG基因型攜帶者血漿TG和TC水平差異無統(tǒng)計學意義。LEPR G3057A位不同基因型攜帶者的血漿血脂水平差異亦無統(tǒng)計學意義(均P＞0.05)，見表3。

表1 兩組間一般情況比較

表2 兩組A668G、G3057A基因型及等位基因分布頻率

表3 LEPR A668 g、G3057A基因型與血脂的關(guān)系(mmol/L)

3 討論

瘦素是肥胖基因編碼的脂源性激素，由脂肪細胞等合成后分泌入血，與特異的運輸?shù)鞍捉Y(jié)合，通過血腦屏障作用于下丘腦的瘦素受體，或直接作用于靶細胞的瘦素受體而發(fā)揮作用，其受體后機制是通過JAK-STAT信號轉(zhuǎn)導途徑實現(xiàn)的，主要活化JAK2-STAT3途徑，在特定基因啟動子區(qū)域發(fā)揮作用，調(diào)節(jié)靶基因轉(zhuǎn)錄［2，3］。瘦素具有廣泛的生物學效應，近年國外研究表明［4］，胰腺存在瘦素受體，瘦素與AP之間有密切關(guān)系，AP時炎癥誘導局部瘦素表達增高，給予外源性瘦素預處理胰腺組織瘦素受體表達亦升高。肥胖者AP預后差，可能與其存在的瘦素抵抗有關(guān)。給予外源性瘦素后的受體表達上調(diào)及受體激活可能緩解瘦素抵抗，從而保護肥胖癥AP患者的胰腺。AP時機體處于高度應激狀態(tài)［5］，體內(nèi)應激激素分泌增加，如糖皮質(zhì)激素、兒茶酚胺水平升高。糖皮質(zhì)激素是瘦素分泌的強烈刺激物，誘導體循環(huán)瘦素水平升高，而升高的瘦素又對糖皮質(zhì)激素起負反饋調(diào)節(jié)，可抑制應激激素的失控反應，因而瘦素可能具有改善AP預后的作用。由于瘦素必須通過與瘦素受體的結(jié)合才可以發(fā)揮其生理功能，因而許多學者推測瘦素受體基因的變異可能影響瘦素功能的發(fā)揮，并與血壓的變化有關(guān)。目前已在LEPR基因20個外顯子中發(fā)現(xiàn)了19種基因多態(tài)現(xiàn)象，但關(guān)于該基因變異與AP發(fā)病的關(guān)系報道結(jié)果不一。

本課題對瘦素受體基因Gln223Arg、PRO1019Pro多態(tài)性與AP的相關(guān)性進行了初步探討。Gln223Arg突變即基因編碼區(qū)第6外顯子668位核苷酸由A變異為G，使編碼第223位的谷氨酰胺(Gln)變?yōu)榫账?Arg);PRO1019pro為一沉默突變，基因編碼區(qū)第20外顯子3057位核苷酸由G變異為A，仍編碼脯氨酸(Pro)。

本組研究顯示AP組和對照組A668 g、G3057A基因型及A668 g等位基因頻率在AP組和對照組間差異無統(tǒng)計學意義;G3057A等位基因A在對照的分布頻率為8.89%，AP組14.13%，差異有統(tǒng)計學意義(χ2=6.544，P＜0.05)。從表3可以看出不同基因攜帶者在血脂水平差異上亦無統(tǒng)計學意義。

本研究結(jié)果提示AP與LEPR基因型頻率分布無明顯相關(guān)性，而G3057A等位基因A可能與AP的發(fā)病相關(guān)。由于遺傳機制比較復雜，一個基因多態(tài)性的表達是通過一個或一些與此多態(tài)性連鎖不平衡的其他的多態(tài)性的效應聯(lián)合發(fā)揮作用。并且AP的發(fā)生還受到地理條件、人的種族、生存環(huán)境等諸多因素的影響。目前有關(guān)AP與瘦素受體基因多態(tài)性關(guān)系的研究較為少見，這個基因變異是否與AP發(fā)病有密切的關(guān)系尚需大樣本、多地域、多民族廣泛深入的協(xié)同研究。

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