響應(yīng)面法優(yōu)化樟芝液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)Antrodin C

夏永軍，張賢芳，許贛榮*

(江南大學(xué)生物工程學(xué)院，工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室，江蘇 無錫 214122)

響應(yīng)面法優(yōu)化樟芝液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)Antrodin C

夏永軍，張賢芳，許贛榮*

(江南大學(xué)生物工程學(xué)院，工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室，江蘇 無錫 214122)

分析樟芝液態(tài)發(fā)酵菌絲體中的活性代謝產(chǎn)物Antrodin C，并以此化合物為目標(biāo)，采用Plackett-Burman設(shè)計和Box-Behnken中心組合響應(yīng)面分析，對樟芝液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)Antrotin C培養(yǎng)基進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)篩選和優(yōu)化。結(jié)果表明：葡萄糖、黃豆粉和MgSO4對Antrodin C的合成影響最為顯著。在葡萄糖 72.0g/L、黃豆粉 5.91g/L、MgSO4 0.614g/L時，樟芝液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)Antrodin C最大預(yù)測值為178.59mg/L。驗證實驗Antrodin C實際產(chǎn)量達(dá)到(177.83±0.32)mg/L，表明實驗建立的模型能較好地預(yù)測實際發(fā)酵產(chǎn)Antrodin C情況。通過對培養(yǎng)基的優(yōu)化，樟芝液態(tài)發(fā)酵Antrodin C產(chǎn)量比優(yōu)化前(95.72mg/L)提高了85.8%。

樟芝；液態(tài)發(fā)酵；Antrodin C；鑒定；Plackett-Burman；響應(yīng)面

樟芝(Antrodia camphorata)是臺灣特有的珍稀藥用真菌，子實體僅附著于臺灣特有的牛樟樹中空腐朽內(nèi)壁生長。長期以來一直被用于解毒、解酒、治療癌癥、止痛等方面，被稱為靈芝之王。近年來，研究發(fā)現(xiàn)樟芝子實體中含有豐富的三萜、甾醇、多糖、腺苷類化合物，具有抑制癌細(xì)胞增生、增加免疫力、抗氧化、抗炎等生理活性[1-6]。但是由于其寄生條件苛刻，且生長極為緩慢，在市場上供給嚴(yán)重短缺，其價格高升至15000美元/kg。

目前，許多學(xué)者以人工培養(yǎng)的方式培養(yǎng)牛樟芝，以緩解市場短缺的壓力，其中深層液態(tài)發(fā)酵已經(jīng)發(fā)展成為工業(yè)化培養(yǎng)模式。2004年，Nakamura等[7]從樟芝液態(tài)發(fā)酵菌體中分離得到5種新的馬來酸和琥珀酸衍生物(Antrodin A～E)，是液態(tài)發(fā)酵樟芝菌體中的主要活性成分，其中Antrodin B和Antrodin C對LLC癌癥細(xì)胞具有良好的抑制效果。Phuong等[8]研究顯示樟芝菌絲體中含有的Antrodin A～E對HCV病毒都具有很好的抑制活性，其中Antrodin A抑制能力最高；研究同時發(fā)現(xiàn)在體內(nèi)Antrodin C可以轉(zhuǎn)化為Antrodin A，從而展現(xiàn)良好的保肝活性，Antrodin A結(jié)構(gòu)式見圖1。Wu等[9]研究發(fā)現(xiàn)樟芝菌絲體中一種新的馬來酸衍生物Antrocinnamomins A能顯著的抑制NO的產(chǎn)生。

目前，樟芝液態(tài)樟芝液態(tài)發(fā)酵的研究多注重于菌體多糖[10-13]、抗氧化性[14]等方面的研究，而三萜類化合物由于檢測方法和目標(biāo)化合物不明確，研究很少。對于Antrodins類化合物的研究主要集中于其藥理活性，而發(fā)酵條件和調(diào)控方面未見相關(guān)報道。這類化合物是樟芝菌絲體的特征活性產(chǎn)物，與樟芝的保肝等藥理活性密切相關(guān)。因此，本實驗對樟芝液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)Antrodin C的培養(yǎng)基進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)篩選和進(jìn)一步的響應(yīng)面優(yōu)化。

圖1 化合物Antrodin C結(jié)構(gòu)式Fig.1 Structural formula of antrodin C

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種

樟芝菌A.camphorata 上海福茂食用菌有限公司。

1.1.2 試劑

葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、MgSO4、KH2PO4、正己烷、乙酸乙酯、無水乙醇均為國產(chǎn)分析純試劑；乙腈(色譜純)、甲醇(色譜純) 德國Meker公司；黃豆粉、豆粕、玉米漿粉 市售。

1.2 儀器與設(shè)備

Agilent 1200高效液相色譜系統(tǒng) 美國Agilent公司；液相色譜-質(zhì)譜儀 美國Waters公司；核磁共振譜儀 瑞士Bruker公司；恒溫?fù)u床 太倉市實驗設(shè)備廠。

1.3 方法

1.3.1 培養(yǎng)基與培養(yǎng)條件

樟芝菌A.camphorata接種于PDA斜面，28℃避光培養(yǎng)9 d，于4℃保藏。

孢子懸浮液制備：取PDA斜面，利用含有吐溫-80 (體積分?jǐn)?shù)0.1% )的無菌水25mL洗下茄子瓶斜面的孢子，鏡檢孢子數(shù)達(dá)到1×106個/mL。

種子培養(yǎng)基：葡萄糖 20g/L、黃豆粉4g/L、MgSO40.5g/L、KH2PO40.5g/L，pH 5.5。液體種子在28℃、110r/min條件下培養(yǎng)4d。

液態(tài)發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基：葡萄糖50g/L、黃豆粉4g/L、MgSO40.5g/L、KH2PO40.5g/L，pH 5.5。接種量為15%，在28℃、110r/min條件下培養(yǎng)7d。

所有培養(yǎng)基均在115℃滅菌20min。

1.3.2 Antrodin C和菌體量分析

1.3.2.1 Antrodin C的確定

取樟芝液態(tài)發(fā)酵菌體粉末30g，無水乙醇50℃振蕩萃取1h，重復(fù)萃取兩次。將萃取液真空濃縮后用乙酸乙酯-水進(jìn)行分配萃取，然后濃縮乙酸乙酯層得到樟芝菌體粗提物，4℃放置備用。將樟芝菌體粗提物進(jìn)行硅膠柱層析，洗脫液為正己烷-乙酸乙酯(體積比為19:1～1:5)，得到10個洗脫組分。將組分6反復(fù)進(jìn)行硅膠柱層析和制備液相，得到化合物AC-2。制備液相色譜條件為：色譜柱：Sepax Sapphire C18(10.0mm×250mm)；流動相：體積比85:15甲醇-水；檢測波長254nm。將制備得到的化合物AC-2進(jìn)行質(zhì)譜和核磁分析，確認(rèn)其結(jié)構(gòu)。

1.3.2.2 Antrodin C含量測定

采用HPLC法測定Antrodin C含量。取樟芝菌發(fā)酵液100mL，抽濾得到較干菌體，加入少量無水乙醇研磨5min，然后用無水乙醇定容至100mL，50℃振蕩萃取1.5h，靜置后0.22μm濾膜過濾，進(jìn)行HPLC分析，分析條件如下：色譜柱：Sepax Amethyst C18(4.6mm×150mm)；流速：1mL/min；檢測波長：254nm；流動相A：水-乙酸體積比200:1：流動相B：乙腈；洗脫梯度如下：0～15min，流動相B 50%～100%；15～15.5min，流動相B 100%～50%；15.5～25min，流動相B 50%。

Antrodin C標(biāo)樣由本實驗室自行制備，經(jīng)過UV、MS、NMR、HPLC分析，其純度≥96%。

1.3.2.3 菌體生物量測定

將發(fā)酵液抽濾后，收集菌體，50℃烘干至恒質(zhì)量，稱質(zhì)量并測定水分。

1.3.3 試驗設(shè)計

1.3.3.1 Plackett-Burman設(shè)計

Plackett-Burman設(shè)計是一種篩選關(guān)鍵影響因素的有效方法，特別是針對多變量的試驗體系。試驗采用12個Plackett-Burman設(shè)計，評估11個因素(包括3個虛擬項)對樟芝液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)Antrodin C的影響。每個因素設(shè)定兩個水平：-1代表低水平，1代表高水平。試驗設(shè)計的因素和水平如表1所示。不同因素的水平取值是根據(jù)前期實驗結(jié)果而設(shè)定的。利用Design Expert 7.0軟件對結(jié)果進(jìn)行分析，篩選出顯著影響樟芝液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)Antrodin C的因素。

表1 Plackett-Burman試驗因素及水平Table 1 Factors and levels of Plackett-Burman design g/L

1.3.3 響應(yīng)面試驗設(shè)計

響應(yīng)面試驗分析同樣采用Design Expert 7.0軟件。根據(jù)Box-Behnken模型的中心組合試驗設(shè)計原理，設(shè)計三因素三水平共15個響應(yīng)面試驗，低中高3個水平分別用-1、0、1代表，試驗設(shè)計見表2。

表3 Plackett-Burman試驗設(shè)計及結(jié)果Table 3 Plackett-Burman design arrangement and results

2 結(jié)果與分析

2.1 Antrodin C的確定和初步測定

分離純化得到的化合物AC-2為黃色油狀液體，UV (乙醇)最大吸收波長為235.2nm，EIMS m/z：330[M+1]+、262、264、173，與文獻(xiàn)報道一致[15]。1H NMR和13C NMR的數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報道的Antrodin C一致[7]。確認(rèn)HPLC圖譜中的化合物AC-2就是Antrodin C。前期對碳氮源進(jìn)行預(yù)篩選，測得Antrodin C產(chǎn)量為95.72mg/L。

2.2 Plackett-Burman設(shè)計法篩選重要因子

實驗過程中每組發(fā)酵設(shè)定3個平行樣，2 8℃、110r/min培養(yǎng)7d，以發(fā)酵終期Antrodin C產(chǎn)量為響應(yīng)值，結(jié)果如表3所示，Antrodin C產(chǎn)量變化幅度30.79～141.33mg/L較大，表明實驗優(yōu)化過程對樟芝液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)Antrodin C非常重要。利用Design Expert 7.0軟件對實驗結(jié)果進(jìn)行分析。

表4 Plackett-Burman試驗分析結(jié)果Table 4 Analysis of variance for the regression model established based on Plackett-Burman design

由表4可知，回歸模型的P值為0.0166(P＜0.05)，說明該模型顯著。即該模型在被研究的整個回歸區(qū)域擬合良好。培養(yǎng)基中各因素對樟芝液態(tài)發(fā)酵Antrodin C產(chǎn)量(R)的影響效應(yīng)大小順序依次為：葡萄糖＞ MgSO4＞黃豆粉＞麥芽糖＞KH2PO4＞豆粕＞蔗糖＞玉米漿粉，其中葡萄糖(P＝0.0084 )、MgSO4(P=0.0099)、黃豆粉(P＝0.0112)是主要的影響因素。其他因素玉米漿粉、麥芽糖、KH2PO4、豆粕、蔗糖雖有影響，但是小于上述3個因素。因此，確定葡萄糖、MgSO4、黃豆粉為影響Antrodin C產(chǎn)量(R)的3個顯著性因素，利用響應(yīng)面分析法對培養(yǎng)基的這3個組分進(jìn)行更深入的研究。

通過Design Expert軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，獲得多元一次回歸方程：

2.3 響應(yīng)面分析

2.3.1 響應(yīng)面回歸模型的建立和分析

表5 Box-Behnken試驗設(shè)計下Antrodin C產(chǎn)量分析Table 5 Box-Behnken experimental design and results for response surface analysis

表6 Box-Behnken試驗設(shè)計下影響Antrodin C產(chǎn)量回歸方程的顯著性檢驗Table 6 Significance analysis for the regression model established based on Box-Behnken design

選取葡萄糖、MgSO4、黃豆粉為自變量，實驗設(shè)計及結(jié)果如表5所示。通過Design Expert軟件對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多項式回歸擬合，獲得樟芝液態(tài)發(fā)酵Antrodin C產(chǎn)量(Y)對葡萄糖、黃豆粉、MgSO4的二次多項式回歸方程為：

該二次項方程及各項方差分析如表6所示。模型F值為25.49，P值為0.0012，說明模型高度顯著。方差分析表明，葡萄糖、黃豆粉、MgSO4的二次項對Antrodin C合成有顯著影響。此模型相關(guān)系數(shù)R2＝0.9787，表明回歸方程的擬合程度較好，預(yù)測值和實測值之間具有高度的相關(guān)性，可以應(yīng)用于樟芝Antrodin C產(chǎn)量的理論預(yù)測。模型中失擬項P值為0.0098，說明由噪音引起模型偏差的概率為0.98%，模型失擬項顯著。

2.3.2 顯著影響因素的交互作用分析

經(jīng)Design Expert軟件分析可得到3個顯著影響因子之間的響應(yīng)面分析圖和等高圖，如圖2～4所示。響應(yīng)面分析圖譜表示兩組獨立變量對樟芝液太發(fā)酵產(chǎn)Antrodin C的影響，而另外一個因素取0水平值。等高線圖譜表示兩組獨立變量的交互作用是否顯著，形狀越橢圓說明交互作用影響越顯著。由圖2～4可知，每組響應(yīng)面圖譜都有明顯的頂峰，即影響因素的最佳值落在試驗設(shè)計的取值范圍內(nèi)。葡萄糖和黃豆粉以及葡萄糖和MgSO4這兩組影響因素兩兩之間的交互作用對Antrodin C的合成均有顯著影響。

圖2 葡萄糖和黃豆粉交互作用對Antrodin C產(chǎn)量影響Fig.2 Effects of glucose and soybean flour on antrodin C production

圖3 葡萄糖和MgSO4交互作用對Antrodin C產(chǎn)量影響Fig.3 Effects of glucose and MgSO4 on antrodin C production

圖4 黃豆粉和MgSO4交互作用對Antrodin C產(chǎn)量影響Fig.4 Effects of soybean powder and MgSO4 on antrodin C production

2.4 樟芝液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)Antrodin C最優(yōu)培養(yǎng)基配方的獲取與驗證

對模型回歸方程進(jìn)行進(jìn)一步分析，回歸模型存在穩(wěn)點，穩(wěn)點為樟芝液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)Antrodin C量最大值，即得到的最優(yōu)培養(yǎng)基組成為葡萄糖72.0g/L、黃豆粉5.91g/L、MgSO40.614g/L時，理論上樟芝液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基Antrodin C產(chǎn)量的最大值為178.59mg/L。

根據(jù)上述回歸分析結(jié)果和響應(yīng)面試驗特點，在實驗水平內(nèi)進(jìn)行驗證，發(fā)酵7d后實際Antrodin C產(chǎn)量為(177.83±0.32)mg/L，菌體生物量達(dá)到13.4g/L，可見該模型能較好地預(yù)測實際產(chǎn)Antrodin C情況。

3 結(jié) 論

本實驗首次對樟芝液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)Antrodin C的培養(yǎng)基進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)篩選和響應(yīng)面優(yōu)化。結(jié)果顯示，統(tǒng)計學(xué)優(yōu)化策略能非常有效的優(yōu)化調(diào)控樟芝液態(tài)發(fā)酵過程中活性代謝產(chǎn)物。葡萄糖、黃豆粉和MgSO4對Antrodin C的產(chǎn)量影響最為顯著。在葡萄糖72.0g/L、黃豆粉5.91g/L、MgSO40.614g/L時Antrodin C產(chǎn)量最大預(yù)測值為178.59mg/L。通過實驗驗證，樟芝液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)Antrodin C產(chǎn)量達(dá)到(177.83±0.32)mg/L，比優(yōu)化前(95.72mg/L)提高了85.8%。實驗中發(fā)現(xiàn)，麥芽糖對樟芝液態(tài)發(fā)酵的影響也較大，能夠較快的促進(jìn)樟芝的生長，因此在后續(xù)實驗中可以考慮利用葡萄糖和麥芽糖的混合碳源進(jìn)行發(fā)酵。

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Optimization of Medium Components for Antrodin C Production by Antrodia camphorata Using Response Surface Methodology

XIA Yong-jun，ZHANG Xian-fang，XU Gan-rong*
(Key Laboratory of Industrial Biotechnology, Ministry of Education, School of Biotechnology, Jiangnan University, Wuxi 214122, China)

The bioactive compound antrodin C was analyzed in the mycelia of A. camphorata in submerged fermentation. The fermentation medium for antrodin C production was optimized using Plackett-Burman design and response surface methodology. The results showed that glucose, soybean powder flour and MgSO4were the major factors that influence the production of antrodin C. Box-Behnken design and response surface analysis were used to determine the optimal response value of the major factors. A quadratic regression model was established. Based on response surface analysis of the mathematical model, the optimal culture medium composition was determined as glucose 72.0 g/L, soybean flour 5.91 g/L and MgSO4 0.614 g/L. The predicted yield of antrodin C was 178.59 mg/L. After cultivation under the optimal conditions for 7 days, the content of antrodin C reached up to (177.83 ± 0.32) mg/L, which was 85.8% higher than before the optimization (95.72 mg/L).

Antrodia camphorata；submerged fermentation；antrodin C；identification；Plackett-Burman；response surface methodology

Q815

A

1002-6630(2012)11-0185-05

2011-06-08

夏永軍(1981—)，男，博士研究生，研究方向為藥用真菌人工培養(yǎng)及其活性產(chǎn)物。E-mail：dreamup@126.com

*通信作者：許贛榮(1954—)，男，教授，博士，研究方向為藥用真菌培養(yǎng)、生物技術(shù)在煙草加工中的應(yīng)用、粗甘油的高附加值轉(zhuǎn)化。E-mail：grxu123@126.com