紅景天苷生物合成的細(xì)胞與分子生物學(xué)研究進(jìn)展

祝順琴，劉萬宏*，戴傳云

(1.西南大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，重慶 400715；2.重慶科技學(xué)院化學(xué)化工學(xué)院，重慶 401331)

紅景天苷生物合成的細(xì)胞與分子生物學(xué)研究進(jìn)展

祝順琴1，劉萬宏2,*，戴傳云2

(1.西南大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，重慶 400715；2.重慶科技學(xué)院化學(xué)化工學(xué)院，重慶 401331)

紅景天苷因其抗氧化、抗疲勞、延緩衰老等生物學(xué)功能成為當(dāng)今天然產(chǎn)物研究的熱門方向。本文綜述了紅景天苷生物合成途徑及途徑中的相關(guān)酶與基因；利用紅景天愈傷組織和細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)紅景天苷的方法，通過遺傳轉(zhuǎn)化獲得毛狀根生產(chǎn)紅景天苷等細(xì)胞與分子生物學(xué)的研究。最后提出細(xì)胞工程和基因工程是解決藥源缺乏的理想途徑之一。

紅景天苷；生物合成；細(xì)胞工程；基因工程

紅景天屬植物在歐洲和亞洲的很多國家有很悠久的藥用歷史，是一種優(yōu)秀的抗外界環(huán)境壓力的適應(yīng)原；紅景天中含有多種活性物質(zhì)，如苷類、黃酮類、香豆素類、生物堿等[1]。其中主要藥用成分為紅景天苷(salidroside)；實驗表明紅景天苷具有抗氧化、抗缺氧、抗疲勞、防輻射、腫瘤抑制等多種生物活性，因此作為原料藥和食品添加劑的使用越來越廣泛[2]；近年來野生資源數(shù)量銳減，主要由以下原因造成：1)絕大多數(shù)紅景天種類生境破碎，加上過度放牧和無計劃人為采挖，致使紅景天野生數(shù)量呈下降趨勢；2)花粉表面光滑，不利于授粉。小孢子敗育降低了生育花粉的數(shù)量[3]；3)近交衰退嚴(yán)重[4]；4)人工引種栽培根腐病較為嚴(yán)重，且對環(huán)境需要較高[5]；隨著對紅景天藥理作用的認(rèn)識不斷深入，如何擴(kuò)大藥源以滿足日益增長的需求，是目前生物學(xué)研究的熱點之一。

利用現(xiàn)代生物技術(shù)開展瀕危物種中特殊功能化合物的生物合成機(jī)理探索是目前生命科學(xué)領(lǐng)域研究熱點之一，其中細(xì)胞與分子生物學(xué)的發(fā)展在這個領(lǐng)域得到了充分的應(yīng)用；本文對紅景天苷生物合成及利用細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)紅景天苷相關(guān)的細(xì)胞與分子生物學(xué)最新研究做一系統(tǒng)綜述。

1 紅景天苷生物合成途徑

1.1 紅景天苷前體酪氨酸的來源

植物體內(nèi)莽草酸(shikimate)經(jīng)莽草酸激酶(shikimate kinase，aroK)催化合成莽草酸-3-磷酸(shikimate 3-phosphate)；后者在5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶(5-enolpyruvyl shikimate-3-phosphate，aroA)催化下與磷酸烯醇式丙酮酸(phosphoenolpyruvate，PEP)結(jié)合，脫去一個磷酸基團(tuán)，形成5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸(5-

enolpyruvylshikimate-3-phosphate，EPSP)；EPSP在分支酸合酶(chorismate synthase，aroC)的作用下，脫去磷酸基團(tuán)合成分支酸(chorismate)；分支酸是莽草酸途徑的重要樞紐物質(zhì)，它以后的去向分為兩個分支[6]：一個分支走向色氨酸(tryptophan)，另一個分支是在分支酸變位酶(chorismate mutas，aroQ)催化下先形成預(yù)苯酸(prephenate)，經(jīng)芳香族氨基酸轉(zhuǎn)氨酶(aromatic-aminoacid transaminase，tyrB)催化加氨合成阿羅酸(arogenicacid)，隨后阿羅酸在阿羅酸脫氫酶(arogenate dehydrogenase，tyrC)的催化合成酪氨酸(tyrosine)進(jìn)入紅景天苷生物合成途徑[7]。

1.2 紅景天苷生物合成途徑

圖1 紅景天苷生物合成途徑Fig.1 Biosynthetic pathways of salidroside

紅景天苷屬于酪氨酸代謝產(chǎn)物，其生物合成途徑己經(jīng)基本闡明(圖1)；來源于莽草酸途徑的酪氨酸在紅景天苷合成關(guān)鍵酶酪氨酸脫羧酶(tyrosine decarboxylase，TyDC)催化下合成酪胺(tyramine)，后者為異喹啉生物堿(isoquinoline alkaloid)生物合成重要前體；酪胺在單氨氧化酶(monoamine oxidase, MAOA)催化合成p-羥苯乙醛(4-hydroxyphenylacetaldehyde，4-HPAA)；隨后4-HPAA在p-羥苯醇脫氫酶(p-hydroxybenzyl alcohol dehydrogenase，areB)還原合成紅景天苷的苷元酪醇(tyrosol)，該反應(yīng)依賴NADH的參與；紅景天苷合成最后一步在關(guān)鍵酶尿苷二磷酸葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶(UDP-glucosyltransferase，UGT)催化作用下以尿苷二磷酸葡萄糖(UDPG)和酪醇為底物合成紅景天苷。

2 紅景天苷生物合成的關(guān)鍵酶與基因

近年來，由于自然生境的破壞和人為無計劃采收紅景天自然資源，導(dǎo)致紅景天瀕危；利用現(xiàn)代生物技術(shù)擴(kuò)大藥源是解決人類需求與自然供給矛盾的有效途徑；由于紅景天苷生物合成途徑基本清楚，利用基因工程遺傳改良合成途徑成為可能，而首先需要解決的就是對途徑中酶與基因的分離以及功能的鑒定；本文從紅景天植物中分離與紅景天苷合成2個關(guān)鍵酶與基因做一簡單綜述。

2.1 酪氨酸脫羧酶(tyrosine decarboxylase，TyDC)

TyDC依賴于吡哆醛-5-磷酸(pyridoxal-5-phosphate，PLP)，催化來源于莽草酸合成途徑酪氨酸脫羧，產(chǎn)生CO2和酪氨。Bartley等[8]對柑橘屬的不同物種的TyDC基因進(jìn)行了較為系統(tǒng)的研究，發(fā)現(xiàn)TyDC基因?qū)π粮チ?synephrine)的合成起到了一定的遺傳決定作用；Lee等[9]采用來源玉米泛素啟動子異位超表達(dá)TyDC基因，在轉(zhuǎn)基因水稻中考察酪氨酸衍生物章魚胺(octopamine)的含量發(fā)現(xiàn)，在轉(zhuǎn)基因水稻的葉片中章魚胺的含量較野生型水稻提高了4倍。Lehmann等[10]采用RACE技術(shù)獲得擬南芥TyDC基因，考察多個外部刺激因子對基因表達(dá)的影響，發(fā)現(xiàn)傷害處理使得基因轉(zhuǎn)錄大大上調(diào)，干旱脅迫也使得基因轉(zhuǎn)錄有所上調(diào)，其他刺激因子如溫度、黑暗差異不顯著，揭示TyDC在植物抗逆性中具有功能；同時構(gòu)建GFP-TyDC考察亞細(xì)胞定位，發(fā)現(xiàn)TyDC定位于細(xì)胞質(zhì)中。Park等[11]利用胚乳特異啟動子表達(dá)編碼N-羥基肉桂酰轉(zhuǎn)移酶(N-hydroxycinnamoyltransferase)和TyDC兩個基因，發(fā)現(xiàn)在植物中含量很低的兩個酪氨酸衍生物對羥基苯乙基阿魏酰胺(feruloyltyramine)和4-香豆酰酪胺(4-coumaroyltyramine)在轉(zhuǎn)基因水稻種子中含量顯著增加，說明TyDC在對酪氨酸衍生物的積累起到重要作用。

由于植物細(xì)胞壁上常結(jié)合有羥基肉桂酸酪氨酰胺等酚類物質(zhì)，以抵御外界病原菌的侵染。增加細(xì)胞中酪氨的含量可能獲得更多的酚類物質(zhì)，增強(qiáng)作物的抗病能力。基于此，Landtag等[12]將來源于歐芹的TyDC基因通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)入馬鈴薯，希望獲得抗病的馬鈴薯。然而實驗結(jié)果與預(yù)期并不一致，在轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的細(xì)胞壁中結(jié)合的酚類物質(zhì)的形式和數(shù)量并沒有發(fā)生變化，卻發(fā)現(xiàn)細(xì)胞合成幾個從未在馬鈴薯中合成的化合物，其中主要的就是紅景天苷；Gyorgy等[13]從紅景天中分離獲得TyDC基因，包含963bp的開放讀碼框，編碼320個氨基酸殘基。通過實時定量PCR檢測發(fā)現(xiàn)，TyDC在紅景天中葉和根中均有表達(dá)，而根中表達(dá)量大大高于葉，這與紅景天苷在植物中不同器官的含量相對應(yīng)，并且高含量株TyDC的基因表達(dá)較低含量株要高，這表明TyDC與紅景天苷的生物合成密切相關(guān)，具有組織特異性。

2.2 尿苷二磷酸葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶(UDP-glucosyltransferase，UGT)

在次生代謝產(chǎn)物合成中，UGT表現(xiàn)出十分重要的功能。甜葉菊(Stevia rebaudiana)葉子中含有至少8個不同的甜菊糖苷化合物，這主要是不同的糖基轉(zhuǎn)移酶在苷元不同位點催化糖基化反應(yīng)而致。Richman等[14]對甜葉菊中UGT做了系統(tǒng)地功能基因組研究，從54個EST序列中獲得12個UGT基因的全長，體外原核表達(dá)并對蛋白進(jìn)行酶功能驗證發(fā)現(xiàn)其中3個UGT可選擇性的糖基化苷元甜葉醇(steviol)上的不同位點?；ㄉ找彩侵参镏兄匾拇紊x產(chǎn)物，主要影響花的顏色，吸引昆蟲授粉。而花色苷的穩(wěn)定性和在水中的溶解度均需要糖基化步驟的參與[15]。

紅景天苷(酪醇-β-D-葡萄糖苷)是由葡糖糖與酪醇以苷鍵結(jié)合的小分子化合物，這類反應(yīng)由糖基轉(zhuǎn)運酶進(jìn)行催化。糖基轉(zhuǎn)運酶一個主要的功能就是將高能單糖殘基轉(zhuǎn)移至糖、蛋白質(zhì)、脂類、核酸以及另外一些小分子等受體分子上完成糖基化。Ma Lanqing等[16]從高山紅景天(Rhodiola sachalinensis A. Bor.)中克隆全長為1598bp糖基轉(zhuǎn)移酶基因UGT73B6，Southern雜交分析表明基因在高山紅景天基因組中存在1個拷貝，Northern雜交結(jié)果表明，基因在根、莖及愈傷組織中均表達(dá)而在葉片中不表達(dá)。用農(nóng)桿菌介導(dǎo)將基因遺傳轉(zhuǎn)化至高山紅景天中，在獲得的轉(zhuǎn)基因愈傷和植株中紅景天苷的含量均明顯高于對照，揭示UGT73B6基因在紅景天苷生物合成中起到一個重要的作用。

3 利用細(xì)胞工程合成紅景天苷的研究

誘導(dǎo)植物愈傷組織，通過細(xì)胞培養(yǎng)的方式生產(chǎn)有價值的次生代謝產(chǎn)物具有廣大的應(yīng)用前景，目前有不少成功的案例如紫草寧、小檗堿、紫杉醇等；然而阻礙利用細(xì)胞生產(chǎn)次生代謝產(chǎn)物大規(guī)模生產(chǎn)的主要瓶頸在于生物量的積累和次生代謝產(chǎn)物產(chǎn)量低下。因此，篩選適合商業(yè)化生產(chǎn)的高產(chǎn)細(xì)胞株是現(xiàn)代生物技術(shù)研究的熱點之一。

3.1 紅景天愈傷組織的誘導(dǎo)及再生

利用細(xì)胞工程大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)紅景天苷的前提之一就是紅景天離體培養(yǎng)的成功，以獲得大量愈傷組織和植物細(xì)胞。盛長忠等[17]采用正交試驗的方法考察不同激素誘導(dǎo)四裂紅景天(Rhodiola quadrifida)愈傷組織和細(xì)胞培養(yǎng)的影響，以MS為基本培養(yǎng)基，激素配比為2,4-D 1mg/L、NAA 2mg/L、6-BA 0.5mg/L、KT 0.1mg/L時誘導(dǎo)率為83.3%；而在最適細(xì)胞培養(yǎng)的激素配比為2,4-D 1mg/L、6-BA 0.1mg/L、KT 0.5mg/L，紅景天愈傷組織在誘導(dǎo)期與培養(yǎng)期激素種類和濃度差異較大。Wu Shuangxiu等[18]對高山紅景天細(xì)胞培養(yǎng)做了系統(tǒng)的研究，發(fā)現(xiàn)外植體來源于子葉、葉和莖均可在3～5d內(nèi)誘導(dǎo)出愈傷組織，誘導(dǎo)率分別為95%、80%和75%，而來源于根的外植體很難獲得愈傷組織；BA是誘導(dǎo)愈傷組織必要的激素，同時IBA、IAA和NAA有利于愈傷組織的形成以及細(xì)胞的生長。

建立愈傷組織再生體系對紅景天的組織快速繁殖及轉(zhuǎn)基因植株獲得等研究提供了有利的理論與實踐基礎(chǔ)；Zych等[19]利用藻酸鈣(calcium alginate)包埋狹葉紅景天(Rhodiola kirilowii)的腋芽與正在分化的愈傷組織，在4℃保藏6周后，轉(zhuǎn)移至無激素的MS培養(yǎng)基中，腋芽與愈傷能發(fā)育成植株；在紅景天生根培養(yǎng)研究發(fā)現(xiàn)激素濃度為IBA 2mg/L、IAA 0.2mg/L的1/2 MS培養(yǎng)基獲得高效的生根率，移栽至珍珠巖、泥炭、土壤質(zhì)量比為1:1:2的基質(zhì)中，成活率達(dá)70%，且植株生理形態(tài)與野生植株相似，這對紅景天的棲息地回復(fù)、種植資源保藏、生物工程應(yīng)用等方面提供了有價值的理論參考[20]。

3.2 懸浮培養(yǎng)合成紅景天苷的研究

利用細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)來取代直接從植株提取次生代謝產(chǎn)物是對自然資源的保護(hù)，特別是對保護(hù)瀕危植物具有重大的意義。然而，由于體外培養(yǎng)細(xì)胞的去分化作用，造成不能形成如同植物中高度的區(qū)室化，導(dǎo)致細(xì)胞合成次生代謝產(chǎn)物的能力有限。因此，培養(yǎng)篩選高產(chǎn)目標(biāo)產(chǎn)物的緊湊愈傷組織聚集體(compact callus aggregates，CAA)是目前植物細(xì)胞工程研究的熱點之一[21]；Xu Jianfeng等[22]以高山紅景天莖段為外植體誘導(dǎo)獲得直徑為2～7mm、表面光滑、球形CAA-type愈傷組織，組織化學(xué)分析顯示CAA結(jié)構(gòu)有利于養(yǎng)分的運輸；搖瓶懸浮培養(yǎng)測定CAA生長及紅景天苷合成動力學(xué)顯示細(xì)胞增殖指數(shù)增長期較短，在細(xì)胞周期中主要以穩(wěn)定期存在，細(xì)胞增長與細(xì)胞合成紅景天苷不偶聯(lián)；細(xì)胞增長量為0.60g/(d·L)；CAA合成紅景天苷含量為0.68%，較分散細(xì)胞產(chǎn)率高6倍。

3.3 前體與誘導(dǎo)子對紅景天苷合成的影響

在植物細(xì)胞培養(yǎng)體系中適當(dāng)?shù)奶砑訉?xì)胞毒害較小的化學(xué)物質(zhì)，特別是添加在生物合成途徑中與目標(biāo)產(chǎn)物距離更為接近的前體物質(zhì)，對提高次生代謝產(chǎn)物的含量積累能起到有效的作用[23]；在懸浮細(xì)胞培養(yǎng)液中添加紅景天苷化學(xué)結(jié)構(gòu)類似物乙酰水楊酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸及酪醇，發(fā)現(xiàn)5個化合物均影響細(xì)胞生長及紅景天苷的合成，其中酪醇會顯著推動紅景天苷的合成，其含量較對照株高26倍[18]；Krajewska-Patan等[24]在培養(yǎng)液中添加3～5mmol/L p-酪醇，紅景天苷積累顯著增加到11.06mg/g，較對照提高了110倍；葡萄糖是細(xì)胞可直接利用的碳源，也是紅景天苷生物合成中的重要原料， Gyorgy等[25]測定了不同濃度葡萄糖中紅景天細(xì)胞合成糖苷類化合物的含量發(fā)現(xiàn)，葡萄糖的增加可以使得一些糖苷類化合物含量上升，其中肉桂醇苷最高上升了2倍，而紅景天苷并沒有增加，暗示紅景天苷合成中的主要限制因素是其前體酪醇在細(xì)胞中的積累。利用黑曲霉、云芝和靈芝考察生物誘導(dǎo)子對紅景天毛狀根合成紅景天苷的影響，發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)子對生物量的積累有很大促進(jìn)，而且對紅景天苷的合成從0.42%高到0.71%[26]；在利用細(xì)胞工程生產(chǎn)紅景天苷工藝中，添加廉價易得的化學(xué)物質(zhì)，在不減少生物量積累的同時，使得紅景天苷含量達(dá)到大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)的目標(biāo)，這將是工業(yè)生產(chǎn)工藝研究的重點。

4 利用毛狀根生產(chǎn)紅景天苷的研究

利用毛狀根培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)藥物、食用色素、香精香料等重要植物次生代謝物。在莨菪發(fā)根中同時過量表達(dá)東莨菪堿生物合成途徑上的兩個限速酶基因pmt和h6h，獲得的轉(zhuǎn)基因發(fā)根中東莨菪堿含量比對照組提高了9倍[27]；目前對轉(zhuǎn)基因藥用植物器官和組織的研究較多，已有青蒿、黃芪、丹參等10多種藥用植物的發(fā)根誘導(dǎo)成功并建立培養(yǎng)系統(tǒng)，這些成功的事例都說明了利用基因工程對植物遺傳轉(zhuǎn)化來生產(chǎn)或提高次生代謝產(chǎn)物含量是切實可行。Zhou Xiaofu等[26]利用發(fā)根農(nóng)桿菌A4菌株侵染高山紅景天(R. sachalinensis)誘導(dǎo)獲得毛狀根，并對轉(zhuǎn)化工程中侵染時間、菌體濃度、共培養(yǎng)時間等參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化；其中毛狀根中紅景天苷含量為0.42%。目前還沒有將關(guān)鍵酶基因TyDC和UGT轉(zhuǎn)入紅景天毛狀根的報道，由于這2個基因在紅景天苷的生物合成中起到重要的調(diào)節(jié)作用，是一個值得研究的方向。

5 利用生物酶法合成紅景天苷

紅景天苷合成的最后一步即酪醇與葡萄糖脫水形成糖苷鍵，而p-酪醇和β-D-葡萄糖是廉價易得的化工原料，因此，采用生物酶法合成紅景天苷的方法是可行的。Zhang Lei等[28]從黑曲霉MS-48中分離純化一個大小為84.6kD的糖苷酶Salidrosidase，在p-酪醇質(zhì)量濃度為1.5g/100mL、β-D-葡萄糖質(zhì)量濃度為6g/100mL、溫度45.8℃、pH值為5.0的條件下反應(yīng)6h，紅景天苷的產(chǎn)率為10%。這是首次報道利用微生物酶合成紅景天苷的報道，為紅景天苷半合成提供了新的方向。

6 展 望

人工培育高含量紅景天苷的紅景天植物栽培品種所需的生境要求高，勞動成本大，很難適應(yīng)日益增長的需求；而且紅景天根腐病的防治提高了種植成本，導(dǎo)致人工種植量很難滿足市場需求[29]；紅景天苷化學(xué)全合成雖然已經(jīng)成功[30]，但是合成過程中參入化學(xué)試劑，很難應(yīng)用到食品行業(yè)；相比之下，利用基因工程遺傳改良紅景天，開展紅景天苷代謝工程研究，進(jìn)而利用細(xì)胞工程生產(chǎn)紅景天苷就具有很大優(yōu)勢；大量的細(xì)胞實驗證實利用細(xì)胞工程手段生產(chǎn)紅景天苷是可行的，目前需要解決的就是工藝參數(shù)的優(yōu)化；而越來越多的分子生物學(xué)證據(jù)顯示紅景天苷生物合成中起到限制性的因素是酪氨的積累，這可能存在反饋抑制；借鑒前人的研究思路，如獲得酪氨反饋不敏感紅景天突變株，可能會大大增加紅景天苷的含量[31]。因而利用基因工程結(jié)合細(xì)胞工程是將來生產(chǎn)紅景天苷的理想途徑，紅景天苷生物合成分子生物學(xué)研究和細(xì)胞工程研究在這方面將起到?jīng)Q定作用，為最終實現(xiàn)紅景天苷商業(yè)化生產(chǎn)奠定理論基礎(chǔ)。

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Advances in Studies on Cellular and Molecular Biology of Salidroside Biosynthesis

ZHU Shun-qin1，LIU Wan-hong2,*，DAI Chuan-yun2
(1.College of Life Science, Southwest University, Chongqing 400715, China；2. College of Chemistry and Chemical Engineering, Chongqing University of Science and Technology, Chongqing 401331, China)

Research into salidroside as a naturally occurring compound is a hot topic nowadays due to its multiple bioactivities such as antioxidant, anti-fatigue, and anti-aging functions. This review covers the following aspects of the cellular and molecular biology of salidroside biosynthesis: (1) biosynthesis pathways and related enzymes and genes; (2) salidroside production by Rhodiola rosea callus and cell culture; (3) salidroside production from hair roots obtained by genetic transformation. Therefore, cell engineering and genetic engineering strategies can provide suitable strategies to solve the lack of drug resources.

salidroside；biosynthesis；cell engineering；genetic engineering

Q291

A

1002-6630(2012)03-0267-05

2011-01-14

重慶市科學(xué)技術(shù)委員會自然科學(xué)基金計劃資助項目(2010BB5296)；重慶市教育委員會科技研究項目(KJ101401)；中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費專項資金資助項目(XDJK2011C017)

祝順琴(1981—)，女，講師，碩士，研究方向為植物基因工程。E-mail：zhushunqin@163.com

*通信作者： 劉萬宏(1979—)，男，講師，碩士，研究方向為藥用植物次生代謝工程。 E-mail：liuwanh@163.com