低劑量X線照射對(duì)誘導(dǎo)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的影響

劉洪鵬

傳統(tǒng)觀點(diǎn)一直認(rèn)為電離輻射是對(duì)生物機(jī)體有害的，即使是很小的照射劑量也會(huì)對(duì)生物體造成損傷。并且隨著照射劑量的增加其造成的損傷也呈線性增加，即所謂的線性無(wú)閾理論(linear no threshold，LNT)。但近年來(lái)有研究表明低劑量照射(Low dose irradiation)對(duì)機(jī)體可能產(chǎn)生有益的作用。對(duì)低劑量電離輻射的生物學(xué)效應(yīng)成為國(guó)內(nèi)外放射醫(yī)學(xué)界研究的熱點(diǎn)。

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)是一類具有多分化潛能的前體細(xì)胞，在應(yīng)激條件下可向不同成體細(xì)胞方向分化。Sabine Francois等認(rèn)為L(zhǎng)DI后損傷部位的組織修復(fù)可能與照射促使骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞“歸巢”、即向損傷部位趨化有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)以BMSCs作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，在對(duì)其進(jìn)行LDI照射后，檢測(cè)照射對(duì)其成骨潛能的影響，以期能夠從細(xì)胞水平部分解釋LDI促進(jìn)大鼠骨折后骨痂礦化的機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 一般資料 間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)的提取取4周齡清潔級(jí)SD大鼠，頸椎脫臼處死，無(wú)菌條件下分離出雙側(cè)股骨，以取磷酸鹽緩沖液(PBS)對(duì)骨髓腔反復(fù)沖洗并吹打混勻獲取細(xì)胞懸液。收集細(xì)胞懸液并將其轉(zhuǎn)移入15 ml離心管中1000 r/min，離心5 min。棄上清液，加入含10% 胎牛血清的α-MEM培養(yǎng)液重懸，以1×106/cm2密度接種于25 cm2的培養(yǎng)瓶中，置于37℃、體積分?jǐn)?shù)為0.05的CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。于接種第24小時(shí)半量換液，待細(xì)胞貼壁后可全量換液。以后各每3 d全量換液1次。

1.2 分組及X線照射處理 細(xì)胞分為6組，分別為0 gy(假照射組)、25 mGy、50 mGy、75 mGy、100 mGy、1 gy(高劑量照射組)。每組設(shè)兩個(gè)培養(yǎng)板，每塊培養(yǎng)板設(shè)4個(gè)復(fù)孔。

1.3 成骨誘導(dǎo) 照射后更換含有10%胎牛血清、地塞米松、抗壞血酸、β-甘油磷酸的DMEM成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液。調(diào)整細(xì)胞濃度至1×104/ml，接種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔加培養(yǎng)基2 ml。同步化培養(yǎng)24 h，待細(xì)胞貼壁后，給予不同劑量X線照射處理。每3 d換液一次，持續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)14 d。

1.4 RT-PCR法檢測(cè)成骨相關(guān)基因 由Genebank查出COL-1、OPG、BGP三種基因的堿基序列，根據(jù)引物設(shè)計(jì)原則選擇相應(yīng)的堿基片段，并分別設(shè)計(jì)上下游引物。三種基因引物序列分別為

COL-1上游引物:5'-GATGCCAATGTGGTTCGTG-3'

下游引物:5'-TTCTTGCGGCTGCCCTCT-5'

OPG上游引物:5'-GGAGCAGAAGACATTGAA-3'

下游引物:5'-TGGACCTGGTTACCTATC-3'

BGP上游引物:5'-GCCCTCACACTCCTCGCCCTAT-3'

下游引物:5'-GCTCCAGGGGATCCGGGTAG-3'

內(nèi)參GADPH上游引物:5'-TGCGTGACATTAAGGAGAAG-3'

下游引物:5'-CTGCATCCTGTCGGCAATG-3'

以Trizol裂解細(xì)胞，提取細(xì)胞內(nèi)的RNA，以如上引物逆轉(zhuǎn)錄制得cDNA并進(jìn)行PCR擴(kuò)增，各組分別吸取6 μl PCR產(chǎn)物與標(biāo)準(zhǔn)100bpDNAmarker在1.2%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，電壓220 V，電泳時(shí)間30 min。紫外光下拍照后以全自動(dòng)凝膠成像分析系統(tǒng)進(jìn)行相對(duì)積分光密度分析，并與內(nèi)參照物GADPH的光密度比較。

圖1 RT-PCR檢測(cè)不同劑量X線照射后成骨相關(guān)基因的表達(dá)情況

2.2 RT-PCR檢測(cè)成骨相關(guān)基因結(jié)果 RT-PCR產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示如圖1。結(jié)果顯示經(jīng)低劑量X線照射后，成骨相關(guān)基因COL-1、OPG、BGP較之假照射組相比，表達(dá)均有增強(qiáng)，其中以75 mGy與100 mGy照射組增強(qiáng)最為顯著，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);而在1 Gy高劑量X線照射后，成骨相關(guān)基因COL-1、OPG、BGP較假照射組相比表達(dá)均有減弱，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。提示低劑量的X線照射在誘導(dǎo)BMSCs向成骨細(xì)胞分化的過(guò)程中可促進(jìn)相關(guān)成骨基因的表達(dá)，增強(qiáng)BMSCs的成骨分化潛能，而高劑量X線照射則會(huì)對(duì)BMSCs的成骨分化有抑制作用(表1)。

表1 不同劑量X線照射后成骨相關(guān)基因的表達(dá)(n=8，)

表1 不同劑量X線照射后成骨相關(guān)基因的表達(dá)(n=8，)

注:與0 Gy組相比，P＜0.05

0 Gy 25 mGy 50 mGy 75 mGy 100 mGy 1000 mGy OPG 1.43±0.096 1.54±0.123 1.68±0.131* 1.73±0.049* 1.72±0.061* 1.37±0.037*COL-1 1.53±0.044 1.60±0.074 1.78±0.089* 1.85±0.118* 1.71±0.126* 1.37±0.049*BGP 1.01±0.038 1.21±0.057 1.25±0.072* 1.32±0.042* 1.31±0.051* 0.71±0.021*

3 討論

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞作為成骨細(xì)胞的前體細(xì)胞，參與骨折后的愈合過(guò)程。因此，我們認(rèn)為低劑量電離輻射促進(jìn)BMSCs向成骨細(xì)胞方向分化可能是其促進(jìn)骨痂礦化的機(jī)制之一。

我們通過(guò)RT-PCR法檢測(cè)了三種成骨基因:COL-1(Collagen I，Ⅰ型膠原)、OPG(osteoprotegerin，骨保護(hù)素)以及BGP(bone gla protein，骨鈣素)。三種基因均對(duì)骨折的愈合和成骨細(xì)胞的礦化有重要作用。

COL-1的合成和分泌是骨組織形成的前提條件，其合成和分泌的增加將對(duì)成骨細(xì)胞的礦化有促進(jìn)作用，且在成骨分化的早期即有表達(dá)［1］，有研究報(bào)道COL-1的缺乏會(huì)導(dǎo)致成骨不全甚至骨折［2，3］。

OPG主要由骨組織中的成骨細(xì)胞產(chǎn)生［4］。其具有增加骨密度和抑制破骨細(xì)胞分化的作用，同時(shí)是是促進(jìn)成骨細(xì)胞分化、成熟的重要細(xì)胞因子［5］。有研究表明將敲除小鼠OPG基因后，可導(dǎo)致嚴(yán)重的骨質(zhì)疏松癥［6］。

BGP又名骨γ-羧谷氨酸包含蛋白，由成骨細(xì)胞合成和分泌，并且不受骨吸收因素的影響，含量比較穩(wěn)定，通過(guò)對(duì)BGP基因的檢測(cè)，可以了解成骨細(xì)胞的活動(dòng)狀態(tài)，從而可以反映誘導(dǎo)的BMSCs向成骨分化的能力。

本實(shí)驗(yàn)中，結(jié)果證實(shí)在接受低劑量X線照射后，誘導(dǎo)分化的BMSCs表達(dá)COL-1、OPG、BGP的量均有明顯增加，以75 mGy與100 mGy組最為顯著，相關(guān)深層機(jī)制的研究有待于進(jìn)一步探究。但可以肯定的是LDI具有促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化潛能的作用，LDI的興奮性效應(yīng)是醫(yī)學(xué)界的重大發(fā)現(xiàn)，在不久的將來(lái)有望應(yīng)用于臨床，用于治療骨折延遲愈合和骨不連等。

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