烏司他丁對鼠在體肺缺血-再灌注損傷中炎癥反應(yīng)的作用

馬立民 段明科 郭雷 王濤 鄭鴻翱

近年來，隨著體外循環(huán)的廣泛開展以及肺移植的逐漸成熟，肺缺血-再灌注(ischemia reperfusion，IR)損傷越來越受到重視。本實(shí)驗(yàn)通過建立大鼠在體的肺IR模型，研究蛋白酶抑制劑:U對肺IR損傷中炎癥反應(yīng)中的細(xì)胞因子IL-10以及sICAM-1的作用，同時應(yīng)用同位素方法驗(yàn)證肺組織通透性的變化。

1 材料與方法

1.1 一般材料 成年健康SD大鼠60只，雄性，體重280～320 g，由汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心提供;烏司他丁(Ulinastatin，U)注射液由廣東天普生化醫(yī)藥股份有限公司提供;白細(xì)胞介素-10(IL-10)和可溶性細(xì)胞黏附分子-1(sICAM-1)試劑盒購自美國R＆D Systems公司(酶聯(lián)免疫吸附法試劑盒);考馬斯蛋白測定試劑盒購自美國PIERCR公司;125I同位素源購自中國同位素公司。

1.2 模型制備 3%戊巴比妥鈉(30 mg/kg)腹腔內(nèi)注射麻醉，麻醉成功后每只大鼠肌內(nèi)注射阿托品0.04 mg/kg，氣管切開后插管連接小動物呼吸機(jī)控制呼吸，呼吸頻率60次/min，吸呼比1∶1.5，工作壓力(即潮氣量):0.02 mPa，吸氧濃度(FiO2)1.0。經(jīng)左胸第5肋間進(jìn)入胸腔，游離左側(cè)肺門，由肺門下方繞過阻斷帶備阻斷，阻斷前5 min每只大鼠由陰莖背靜脈注射肝素50 U(生理鹽水稀釋，每只0.5 ml)。

1.3 動物分組 36只SD大鼠隨機(jī)分為6組(每組6只):假手術(shù)組(S組):完成以上手術(shù)操作，但肺門不阻斷;缺血0.5 h組(Ⅰ組):阻斷肺門后造成肺缺血30 min;缺血-再灌注組(IR組)，又分為兩個時段:缺血30 min，再灌注30 min組(IR30)和再灌注120 min組(IR120);烏司他丁組，亦分為兩個時段:缺血30 min后，再灌注30 min組(U30)和再灌注120 min組(U120)。烏司他丁組在再灌注前5 min由陰莖背靜脈緩慢注射烏司他丁75000 U/kg，IR組注射同等劑量的生理鹽水。在再灌注期間，每隔1 h由皮下注射生理鹽水0.5 ml以補(bǔ)充水分丟失。試驗(yàn)結(jié)束后在各時點(diǎn)用放血法處死動物，取相同部位部分新鮮左肺組織用4%多聚甲醛固定，作常規(guī)光鏡檢查，其余肺組織放入-70℃冰箱待測。

1.4 觀察指標(biāo) 及其檢測用ELISA方法分別檢測肺組織中IL-10和血漿sICAM-1的含量。采用考馬斯亮藍(lán)蛋白測定法檢測肺組織中的蛋白含量。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理 數(shù)據(jù)用SPSS 11.0版統(tǒng)計軟件進(jìn)行單因素方差分析(ANOVA)，組間比較采用q檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 肺組織IL-10水平的變化 正常情況下肺組織中IL-10有少量表達(dá)，單純?nèi)毖?0 min后IL-10水平即有升高，與S組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)，再灌注后各時段亦有升高。應(yīng)用U后各時段和IR組相應(yīng)時段相比IL-10水平顯著高于S組(P＜0.01)。見表1。

2.2 血漿sICAM-1水平的變化 缺血30 min后sICAM-1水平雖然有所升高，但和S組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。再灌注30和120 min后sICAM-1明顯升高，和S組及Ⅰ組相比均差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)，應(yīng)用U后各時段sICAM-1水平明顯低于IR組(P＜0.01)。見表1。

表1 各組大鼠IL-10、sICAM-1水平的變化

2.3 肺組織通透性的變化(125IBSA漏出量表示，單位:counts.min-1 g tissue/ml blood)缺血30 min后肺組織通透性有所升高(0.085±0.014)，和S組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，IR30 min(0.164±0.018)和 120 min(0.227±0.024)和S組和Ⅰ組相比均差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)，而U組各時段(0.092±0.015，0.104±0.009)和IR組各時段相比明顯降低(P＜0.01)。見圖1。

圖1 肺組織中125IBSA漏出量的變化

3 討論

烏司他丁是從人類新鮮尿液中分離純化出來的一種糖蛋白，是一種蛋白酶抑制劑。近年來研究顯示:U不但能夠抑制多種蛋白酶及糖和脂類的多種水解酶活性，而且還可以抑制心肌抑制因子的產(chǎn)生、改善休克時的微循環(huán)狀態(tài)、抑制炎癥介質(zhì)的過度釋放以及清除氧自由基等多種特殊的藥理作用［1］。大量的動物和臨床研究均證實(shí)了IR過程中的炎癥反應(yīng)是造成肺再灌注損傷的重要機(jī)制之一，與肺IR損傷有關(guān)的炎癥反應(yīng)過程包括炎癥細(xì)胞的趨化、浸潤、激活以及炎癥因子的合成和釋放。因此，拮抗炎癥反應(yīng)的損傷性因素，應(yīng)用各種策略重建體內(nèi)致炎與抗炎機(jī)制的平衡成為減輕IRI的重要措施［2］。

IL-10作為人體內(nèi)自然產(chǎn)生的抗炎介質(zhì)，一方面抑制炎性細(xì)胞的黏附、浸潤，另一方面抑制各種促炎性細(xì)胞因子的合成與釋放，重建體內(nèi)炎癥介質(zhì)及抗炎介質(zhì)的平衡。研究證明在肺IR損傷中，無論是內(nèi)源性還是外源性的IL-10都可以減輕再灌注損傷，改善肺功能，發(fā)揮保護(hù)作用［3］。本實(shí)驗(yàn)中正常肺組織中IL-10幾乎無表達(dá)，在缺血階段IL-10就有上升，表明體內(nèi)的抗炎機(jī)制在缺血期就已經(jīng)啟動，再灌注后隨著肺內(nèi)的炎性改變的增強(qiáng)，IL-10水平亦相應(yīng)升高，并隨著再灌注時間的延長而增加，體現(xiàn)出機(jī)體本身對于IR致炎反應(yīng)的負(fù)調(diào)節(jié)。應(yīng)用U后IL-10的表達(dá)和再灌注組比明顯增強(qiáng)，表明UTI可以促進(jìn)內(nèi)源性的IL-10的產(chǎn)生，從而可能起到抑制炎癥反應(yīng)，減輕肺組織IR損傷。

sICAM-1存在于人的血清中，是除了位于細(xì)胞膜表面的mICAM-1以外的另一種形式。正常狀況下，血液中含量極低，但在炎癥反應(yīng)時可被 TNF-α、IL-1、LPS等誘導(dǎo)而大量表達(dá)，在介導(dǎo)PMN活化與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中具有重要作用［4］。研究報道，sICAM-1可以活化肺泡巨噬細(xì)胞，誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞的黏附和聚集而產(chǎn)生肺損傷［5］。sICAM-1可通過與CD18相互作用，激發(fā)損傷局部的PMN釋放彈性蛋白酶，造成遠(yuǎn)處器官功能失調(diào)和損傷。急性肺損傷時，肺泡灌洗液中的sICAM-1的濃度明顯升高且和肺損傷的程度呈正相關(guān)［6］。血中sICAM-1濃度升高可由于激活的內(nèi)皮細(xì)胞表面表達(dá)ICAM-1增多或繼發(fā)于內(nèi)皮細(xì)胞損傷的蛋白酶溶解作用，故sICAM-1濃度的升高可以作為內(nèi)皮細(xì)胞損傷或激活的標(biāo)志。單純?nèi)毖?0 min肺組織sICAM-1的表達(dá)和對照組相比無明顯差異，再灌注后表達(dá)明顯增加，再灌注0.5 h和2 h和S組及Ⅰ組相比均有明顯的升高，說明IR可以明顯的增加sICAM-1，進(jìn)一步促進(jìn)PMN的聚集、激活等炎癥級聯(lián)反應(yīng)，引起局部及遠(yuǎn)隔器官的損傷。應(yīng)用UTI后各時段和再灌注相比sICAM-1水平顯著降低，表明UTI不僅可以抑制早期的sICAM-1蛋白質(zhì)前體的活化，而且可以從基因水平抑制其mRNA的表達(dá)，從而起到抑制sICAM-1的致炎作用，減輕肺組織的再灌注損傷。

綜上，U通過促進(jìn)內(nèi)源性IL-10的表達(dá)，抑制sICAM-1的釋放而起到抑制肺IR損傷中炎癥反應(yīng)的作用，降低肺組織的通透性，減輕肺組織水腫和肺泡水腫。在臨床體外循環(huán)或肺移植中適當(dāng)應(yīng)用U，可能有益于控制肺IR中的炎癥放大作用，避免或減輕肺IR損傷。

［1］ 黃文彬，申捷，張琳，等.烏司他丁對鼠急性肺損傷的保護(hù)作用及相關(guān)因子的表達(dá).中華急診醫(yī)學(xué)雜志，2010，19(1):37-42.

［2］ Calixto JB，Campos MM，Otuki MF，et al.Anti-inflammatory compounds of plant origin.Part II.Modulation of pro-inflammatory cytokines，chemokines and adhesion molecules.Planta Med，2004，70(2):93-103.

［3］ 任大賓，孫仁宇.白介素10的抗炎功能及其分子機(jī)制.國外醫(yī)學(xué)呼吸系統(tǒng)分冊.2005，25(3):175-178.

［4］ Witkowska1 AM，Borawska MH.Soluble intercellular adhesion molecule-1(sICAM-1):an overview.Eur Cytokine Netw.2004，15(2):91-98.

［5］ Kanayama S，Yamada Y，Onogi A，et al.Molecular structure and function analysis of bikunin on down-regulation of tumor necrosis factor-alpha expression in activated neutrophils.Cytokine，2008，42(2):191-197.

［6］ Mendez MP，Morris SB，Wilcoxen S，et al.Shedding of soluble ICAM-1 into the alveolar space in murine models of acute lung injury.Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol，2006，290(5):L962-970.