低滲造影劑對老年糖尿病大鼠腎毒性的研究

王瑞強 王毅 李濤 劉闖 蒲娟娟 于潔

隨著現(xiàn)代醫(yī)學影像診斷和介入治療的快速發(fā)展，血管內(nèi)造影劑的應用越來越普及，造影劑腎病(contrast induced nephropathy，CIN)的發(fā)病率也呈上升趨勢。造影劑腎病是指血管內(nèi)注射碘造影劑后48 h內(nèi)，在排除其他病因的前提下，腎功能發(fā)生損害，血清肌酐水平升高0.5 mg/dl(44.2 μmol/L)或比基礎值升高25%以上。由造影劑引起的急性腎功能衰竭是醫(yī)院獲得性腎功能衰竭的常見原因，居于醫(yī)院內(nèi)獲得性腎衰竭第3位［1］。既往無腎臟疾病的患者，其CIN發(fā)病率為3.35%～8%，平均5%，而對于患有糖尿病或腎臟疾病者，CIN發(fā)病率則明顯上升高達50%［2］。老年患者由于腎小球硬化、腎血流量減少等因素的影響，在應用造影劑時更容易產(chǎn)生一系列不良反應［3］。

糖尿病人群中CIN的發(fā)病機制尚未完全明確，氧化應激以及信號傳導是目前研究的熱點。本研究通過制作老年糖尿病大鼠模型，觀察低滲造影劑對腎功能和腎組織一氧化氮(NO)及谷胱甘肽(GSH)的影響，并探討NO及GSH在CIN中的作用，從而進一步揭示CIN的發(fā)病機制。

1 材料與方法

1.1 一般材料 SD大鼠，6～7月齡雄性，體質(zhì)量420～520 g，清潔級，40只，隨機取出10只作為正常對照組(SD組，n=10)，其余給予一次性腹腔注射鏈脲佐菌素(STZ Sigma公司)60 mg/kg(STZ用0.1 mmol/L，pH4.5的枸櫞酸鈉緩沖液配制成2%溶液)，正常對照組給予腹腔注射等體積枸櫞酸鈉緩沖液。注射72 h后尾靜脈取血檢測血糖≥16.7 mmol/L、尿糖+++以上者表示老年糖尿病大鼠造模成功。大鼠飼養(yǎng)期間每周檢測空腹尾靜脈血血糖1次，根據(jù)血糖情況每天給予中效人基因重組胰島素1～2 U，早晨一次性皮下注射，維持空腹血糖在16～26 mmol/L之間。每間隔2周測量1次體重。

8周后，26只老年糖尿病大鼠造模成功。老年糖尿病大鼠隨機分成2組:糖尿病對照組(DM組，n=13);糖尿病+低滲造影劑組(LOCM組，n=13)。LOCM組經(jīng)尾靜脈注入歐乃派克350(10 ml/kg);DM組和SD組經(jīng)尾靜脈注入生理鹽水(10 ml/kg)。注射2 d后處死大鼠，處死當天在1%戊巴比妥麻醉下行心臟穿刺收集血標本、腎臟標本。

1.2 檢驗項目與方法 血肌酐、尿素氮、血糖由全自動生化分析儀完成。

取出大鼠腎臟組織，分離出部分腎皮質(zhì)，加入冰冷生理鹽水制成10%組織勻漿，低溫離心機離心，取上清液，測定GSH含量及NO水平(試劑盒由南京建成生物工程研究所提供)，嚴格按照試劑盒說明操作。

2 結果

2.1 一般情況的變化 實驗期間，正常對照組大鼠體重明顯增加，精神狀態(tài)良好，反應靈敏，動作敏捷，毛色光澤，無一只死亡。糖尿病大鼠出現(xiàn)多飲、多食、多尿、消瘦、精神萎靡、反應遲鈍、毛無光澤，四只死亡。

2.2 腎功、血糖的變化 造模成功后，糖尿病大鼠血糖水平即明顯高于正常對照組，并維持高水平至實驗結束。LOCM組、DM組與SD組相比，血肌酐和尿素氮升高明顯，差異有統(tǒng)計學意義。LOCM組與DM比較血肌酐、尿素氮升高，差異無統(tǒng)計學意義(見表1)。

2.3 腎臟組織勻漿一氧化氮、谷胱甘肽的變化 DM組與SD組比較，一氧化氮、谷胱甘肽降低，差異有統(tǒng)計學意義。應用造影劑后，LOCM組與DM組比較一氧化氮降低更明顯，差異有統(tǒng)計學意義(見表2)。

表1 各組大鼠血肌酐、尿素氮和血糖水平比較()

表1 各組大鼠血肌酐、尿素氮和血糖水平比較()

注:與正常對照組比較，*P＜0.01，■P＜0.05

組別 例數(shù)(只) BUN(mmol/L) Scr(μmol/L) BS(mmol/L)正常對照組10 5.44±1.32 46.80±9.06 5.75±0.58糖尿病對照組 13 7.71±1.21■ 56.15±9.49■ 23.36±6.62*糖尿病+低滲造影劑組 13 8.23±1.18■ 61.31±11.11* 24.93±7.52*

表2 各組大鼠一氧化氮、比較()

表2 各組大鼠一氧化氮、比較()

注:與正常對照組比較，*P＜0.01，■P＜0.05;與糖尿病對照比較，▲P＜0.05

組別 例數(shù)(只) NO(μmol/mg pro) gsh(μmol/g pro)正常對照組10 0.31±0.05 2.23±0.16糖尿病對照組 13 0.24±0.04* 2.04±0.24■糖尿病+低滲造影劑 13 0.15±0.05＊▲ 1.92±0.21*

3 討論

糖尿病人群CIN的發(fā)病機制尚未完全明確，目前認為可能是多機制參與的，主要的發(fā)病機制有血流動力學改變導致腎臟缺氧性損傷、造影劑的腎毒性效應以及氧化應激等。臨床上使用的造影劑分為離子型高滲、離子型和非離子型等滲與低滲造影劑。多數(shù)學者認為低滲、等滲造影劑的安全性優(yōu)于高滲造影劑［4］。本試驗選用的是在臨床廣泛應用的低滲造影劑。本研究發(fā)現(xiàn)糖尿病+低滲造影劑組與糖尿病對照組比較血肌酐、尿素氮升高不明顯，但是與正常對照組比較升高明顯，可能與我們選用的低滲造影劑低腎毒性有關。

活性氧(ROS)損傷作用越來越受到重視。ROS含量超過抗氧化劑含量時，常發(fā)生氧化應激反應，而且ROS作為細胞外信號分子，參與血管收縮活動。氧化應激也被認為與糖尿病的發(fā)病以及糖尿病并發(fā)癥的快速進展相關［5］。有文獻指出糖尿病患者本身的抗氧化能力(如谷胱甘肽過氧化物酶、超氧化物歧化酶、過氧化氫酶以及維生素C，E，A等)已經(jīng)降低［6］。而且糖尿病人群常同時伴有高血壓、代謝障礙、多支冠狀動脈病變等其他危險因素，可能也與該人群CIN高發(fā)病率相關。由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸結合而成的谷胱甘肽(GSH)被認為是復雜的抗氧化網(wǎng)絡的中心，其半胱氨酸上的巰基為其活性基團，可以直接清除氧自由基發(fā)揮抗氧化作用［7］。但是谷胱甘肽水平隨著年齡增長而降低，從而老年人容易受到氧化應激的威脅［8］。本實驗發(fā)現(xiàn)老年糖尿病大鼠的GSH水平下降，應用造影劑后與糖尿病對照組大鼠比較GSH水平輕微下降。老年糖尿病大鼠的低GSH水平，可能使其更易受到造影劑的損害。

腎臟血管收縮因子(包括腎素一血管緊張素一醛固酮系統(tǒng)、內(nèi)皮素、腺苷、鈣離子等)和舒張因子(一氧化氮和前列腺素等)比例失調(diào)導致血流動力學改變與CIN密切相關。生物體內(nèi)NO主要由一氧化氮合成酶以左旋精氨酸為底物，在還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)，黃素腺嘌呤二核苷酸(FAD)，黃素單核苷酸(FMN)，四氫生物蝶呤(H4B)等因子輔助下生成。生物體內(nèi)NO通過擴散或其它方式傳輸?shù)洁徑毎Y合并活化可溶性血紅素蛋白鳥苷酸環(huán)化酶，生成環(huán)磷酸鳥苷，參與多種信號途徑。NO作為信使和細胞因子參與血壓調(diào)節(jié)、神經(jīng)信息傳遞及抗感染防御等重要功能［9］。本研究發(fā)現(xiàn)糖尿病大鼠模型建立8周后，NO含量顯著低于正常對照組，應用造影劑后NO水平進一步下降。老年糖尿病大鼠已經(jīng)存在NO代謝障礙，推測低滲造影劑進一步削弱了NO的合成或加速了NO的消耗，繼而出現(xiàn)持久的腎內(nèi)血管收縮，導致腎臟缺血、缺氧，損傷腎小管，腎小球濾過率下降，加重腎功能損害。低滲造影劑影響NO的機制尚不明確，低滲造影劑是否影響到一氧化氮合成酶的合成，以及如何干預一氧化氮合成酶的功能(例如是否影響到是否影響到一氧化氮合成酶的電子傳遞，以及一氧化氮合成酶的空間構型是否改變)是我們團隊目前的研究內(nèi)容。

綜上所述，低滲造影劑可以引起糖尿病大鼠腎功能的減退，這可能與其影響NO的代謝有關，這為我們今后進一步的研究指明方向。

［1］Nash K，Hafeez A，Hou S.Hospital-acquired renal insufficiency.Am J Kidney Dis，2002，39(5):930-936.

［2］Wayabill MM，Wyabill PN.Contrast media-induced nephrotoxicity:identification of patients at risk and algorhitms for prevention.J Vasc Interv Radiol，2001，12(1):3-9.

［3］Tumlin J，Stacul F，Adam A，et al.Pathophysiology of contrastinduced nephropathy.AM J Cardiol，2006，98(6):14-20.

［4］Rudnick MR，Goldfarb S，Wexler L，et al.Nephrotoxicity of ionic and nonionic contrast media in 1196 patients:a randomized trial.The Iohexol Cooperative Study.Kidney Int，1995，47(1):254-261.

［5］Abo-Salem OM，El-Edel RH，Harisa GE，et al.Experimental diabetic nephropathy can be prevented by propolis:Effect on metabolic disturbances and renal oxidative parameters.Pak J Pharm Sci，2009，22(2):205-210.

［6］Yoshida SI，Hashimoto T，Kihara M，et al.Urinary oidative stress markers closely reflect the efficacy of Candesartan treatment for diabetic nephropathy.Nephron Exp Nephrol，2009，111(1):20-30.

［7］Stojiljkovi V，Peji SA，Kasapovi J，et al.Glutathione redox cycle in small intestinal mucosa and peripheral blood of pediatric celiac disease patients.An Acad Bras Cienc，2012，84(1):175-184.

［8］Richie JP Jr，Das A，Calcagnotto AM，et al.Age related changes in selenium and glutathione levels in different lobes of the rat prostate.Exp Gerontol，2012，47(3):223-228.

［9］Palmer RM，F(xiàn)errige AG，Moncada S.Nitric oxide release accounts for the biological activity of endothelium-derived relaxing factor.Nature，1987，327(6122):524-526.