蘭溪余糧山柿子軟腐病的發(fā)病機制研究

申屠旭萍，俞曉平，董勝張，馬 正，蔣芝云，吳曉峰，范金根

（1.中國計量學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院，浙江省生物計量及檢驗檢疫技術(shù)重點實驗室，浙江 杭州 310018；2.蘭溪市森林病蟲防治檢疫站，浙江 蘭溪 321100）

柿樹在我國已有2000多年的栽培史.柿子含1%以上可溶性糖，其含胡蘿卜素、維生素C及鈣、磷、鐵等礦物質(zhì)勝過蘋果、梨、桃、李等果品，還具有止血潤便、降血壓、生津潤肺治咽喉痛等醫(yī)療保健的功效［1－4］.浙江蘭溪的大紅柿聞名省內(nèi)外，曾多次獲得省、市級優(yōu)質(zhì)農(nóng)產(chǎn)品金獎.目前蘭溪市的柿子種植面積達(dá)1135公頃，已成為當(dāng)?shù)剞r(nóng)民的主要經(jīng)濟來源之一.隨著柿樹在蘭溪市種植面積的不斷擴大和集約化程度的提高，柿樹病蟲害種類不斷增加，導(dǎo)致柿子產(chǎn)量損失嚴(yán)重，質(zhì)量明顯下降，給果農(nóng)造成了重大的經(jīng)濟損失［5－9］.2006年以來，又有一種新病害在蘭溪暴發(fā)成災(zāi)，該病害主要發(fā)生在果實采摘期，導(dǎo)致柿子部分變軟變腐，喪失商品性.2007年當(dāng)?shù)匾蜻@種病害造成5%以上的果實不能正常進(jìn)入市場，損失慘重.僅蘭溪市黃店鎮(zhèn)余糧山一個村就損失柿子果產(chǎn)量40噸以上，給廣大柿農(nóng)造成了重大的經(jīng)濟損失.

明確導(dǎo)致柿果軟腐病的發(fā)病機理，提出合理的病害控制技術(shù)對減少因該病害引起的經(jīng)濟損失和增加果農(nóng)的收入非常必要，同時對促進(jìn)蘭溪市乃至全國的柿果產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展意義重大.該病害是病原性病害、生理性病害或者是由環(huán)境污染因素引起的？本研究開展了病原微生物分離、高效合理的防治措施篩選和環(huán)境污染因子對病害發(fā)生的影響研究等工作，為明確柿果軟腐病害的發(fā)生機制奠定基礎(chǔ).

1 材 料

1.1 試驗地點

蘭溪市黃店鎮(zhèn)余糧山柿子種植區(qū).

1.2 病原菌培養(yǎng)基

1）牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl 5g，瓊脂20g，水1L；

2）PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200g，葡萄糖20g，瓊脂20g，水1L；

3）高氏一號合成培養(yǎng)基：可溶性淀粉20g，KNO31g，NaCl 0.5g，K2HPO40.5g，MgSO40.5g，F(xiàn)eSO40.01g，瓊脂20g，水1L；

4）馬丁氏培養(yǎng)基：葡萄糖10g，蛋白胨5g，KH2PO41g，MgSO40.5g，瓊脂20g，水1L［10］；

5）柿子汁誘導(dǎo)培養(yǎng)基：在上述培養(yǎng)基中分別添加新鮮柿子汁組成不同配方培養(yǎng)基，添加量為1ml／10ml.

1.3 供試殺菌劑

丙森鋅70%可濕性粉劑（拜耳作物科學(xué)有限公司生產(chǎn)），687.5g／L氟菌·霜霉威懸浮劑（商品名：68.75%銀法利懸浮劑，拜耳作物科學(xué)有限公司生產(chǎn)），722g／L霜霉威鹽酸鹽（商品名：普力克水劑，拜耳作物科學(xué)有限公司生產(chǎn)），400g／L嘧霉胺（商品名：施加樂懸浮劑，拜耳作物科學(xué)有限公司生產(chǎn)），430g／L戊唑醇（商品名：好力克懸浮劑，拜耳作物科學(xué)有限公司生產(chǎn)），甲基硫菌靈70%可濕性粉劑（江蘇龍燈化學(xué)有限公司生產(chǎn)），硫酸鏈霉素72%可濕性粉劑（石家莊通泰生化有限公司生產(chǎn)），溴硝醇20%可濕性粉劑（遼寧丹東市農(nóng)藥總廠生產(chǎn)）和噻菌銅20%懸浮劑（浙江龍灣化工有限公司生產(chǎn)）.

2 試驗方法

2.1 病原組織微生物的分離與鏡檢

2.1.1 病果表面消毒 75%酒精消毒5min→無菌水沖洗→10%次氯酸鈉消毒5min→無菌水沖洗.

2.1.2 病菌固體培養(yǎng)基平板分離 去柿子皮，用無菌刀切取病原組織4～5mm大小的塊狀移至固體平板培養(yǎng).同時，另切取同樣大小組織小塊置于無菌水中，充分搗碎，將菌懸液稀釋成10－1，10－2，10－3三個梯度，分別涂布.將含牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基的平板置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1～2d.將含PDA培養(yǎng)基、高氏一號合成培養(yǎng)基和馬丁氏培養(yǎng)基的平板置于28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～5d.

2.1.3 病菌液體培養(yǎng)基誘導(dǎo)培養(yǎng) 去柿子皮，用無菌刀切取組織4～5mm小塊移至含有柿子汁的液體誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng).

2.1.4 用無菌接種環(huán)挑取柿子汁涂片，干燥，固定，用草酸銨結(jié)晶紫溶液染色，鏡檢.

2.2 殺菌劑的防治試驗

采用東方紅3WB－15X背負(fù)式機動噴霧機和延伸噴頭直接對柿子樹噴施不同的殺菌劑，噴施要求藥液霧滴分布均勻，覆蓋率高，藥液濕潤葉面和果面不產(chǎn)生流失為宜.共設(shè)9種殺菌劑，每種藥劑設(shè)3個地點處理，每個處理設(shè)3次重復(fù)，稀釋農(nóng)藥的清水作為陰性對照.施藥時間為采摘前期（7月～9月間），共計噴霧3次.柿子采摘期檢查防治效果.

2.3 SO2處理對柿子的影響

采用2.5L密閉的微波爐專用盒子（直徑9.6cm、高8.8cm），每個盒子中放置大小均一成熟度較一致的柿子10個，在盒子中放置一個敞口且加有不同量的Na2SO3和稀H2SO4溶液的小玻璃瓶1只，然后密閉盒子.利用復(fù)分解反應(yīng)Na2SO3＋H2SO4＝Na2SO4＋SO2↑＋H2O產(chǎn)生SO2氣體.密閉容器中SO2含量分別為2.38mg、0.59mg、0.15mg、0.04mg、9.30×10－3mg、2.33×10－3mg、5.81×10－4mg、1.45 ×10－4mg、3.63×10－5mg、9.08×10－6mg、2.27×10－6mg共11個處理，對照組只有柿子不加SO2，每日觀察盒子內(nèi)柿子的變化.

2.4 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)分析在SPSS15.0統(tǒng)計軟件下處理.

3 結(jié)果與分析

3.1 病原微生物對柿子軟腐病的影響

對2010年9月27日、10月8日和10月17日采摘回的3批次病果分別進(jìn)行病原菌分離試驗.結(jié)果表明：用不同的培養(yǎng)基和固體及液體培養(yǎng)后，平板上未見有細(xì)菌、放線菌和真菌菌落生長，液體培養(yǎng)基也未變渾濁或見絲狀微生物生長.進(jìn)一步對柿子汁涂片染色后觀察，在顯微鏡下未見微生物細(xì)胞，具體結(jié)果，見圖1.

圖1 柿子病原組織微生物的分離培養(yǎng)結(jié)果Figure 1 Isolation and culture of pathogenic microorganism in Diospyros kaki tissue

3.2 殺菌劑對軟腐病的防治

在2010年7—9月間，分別選擇前兩年軟腐病較嚴(yán)重的3個種植區(qū)域進(jìn)行防治試驗.噴施后柿子成熟時每個試驗區(qū)域每個處理分別采摘30個左右果子進(jìn)行軟腐病統(tǒng)計，分析農(nóng)藥對軟腐病的防治效果，見表1.

試驗結(jié)果表明，在3個區(qū)域利用9種殺菌劑處理后柿子的病果率和對照無顯著性差異，這也間接表明供試殺菌劑對該病害沒有明顯的防治效果.

表1 九種殺菌劑對柿子軟腐病的防治效果Table 1 Control efficacy of nine kinds of fungicides against soft－blet disease of Diospyros kaki

3.3 正常果子和病果形態(tài)觀察

剛從樹上采摘下來的病果癥狀為頂部顏色比其他部位顯紅，且較軟（圖2）.在常溫放置數(shù)天后，柿子其他部分也逐漸變紅，原來頂部先變紅的部分變干，顏色上和其他部位已無差別.掰開后肉眼觀察未見有病原菌菌落生長，也無腐爛現(xiàn)象.把正常柿子另挑出，放置數(shù)天后發(fā)現(xiàn)頂部也變干變褶皺，只是顏色比病果稍淺（圖3）.

圖2 病果Figure 2 Diseased Diospyros kaki stored for several days

圖3 放置數(shù)天后正常果子與病果外觀比較Figure 3 Appearance of non－diseased and deseased fruit

3.4 SO2對柿子的影響

盡管實驗室密閉模擬試驗和種植區(qū)環(huán)境有一定的差異，但10d后觀察到SO2處理的盒子中出現(xiàn)柿子先變紅現(xiàn)象，腐熟度比對照明顯高.其中密閉容器中SO2含量為2.38mg，0.59mg，0.15mg，0.04mg，也就是質(zhì)量濃度分別為9.52×10－1mg／L，2.36×10－1mg／L，6.00×10－2mg／L，1.6×10－2mg／L的腐熟現(xiàn)象明顯（圖4），這初步說明SO2氣體可以刺激柿子早熟變軟.

圖4 SO2對柿子軟腐的影響Figure 4 Influence of SO2on Diospyros kaki soft－blet

4 討 論

針對2006年以來在蘭溪余糧山柿子種植區(qū)新出現(xiàn)的病害——柿子軟腐病，本研究分別從病果病原菌分離鑒定、不同殺菌劑的防治試驗、不同環(huán)境因子的監(jiān)測和對病害發(fā)生的影響等3方面入手開展了該病發(fā)生的機制初探.選擇了適合細(xì)菌、放線菌和真菌培養(yǎng)的培養(yǎng)基，補充了加入柿子汁的誘導(dǎo)培養(yǎng)基，結(jié)果均未分離到病原菌.防治試驗中選用了針對真菌性病害和細(xì)菌性病害的殺菌劑，并且采用了不同的防治濃度，但未見有防效.從形態(tài)上觀察病果和正常果子不同主要在于顏色，未見有腐爛現(xiàn)象.結(jié)合上述結(jié)果可以初步判斷該病害不是由病原菌引起的，也即非病理性病害.

實地調(diào)查中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)?shù)厥赁r(nóng)施用的農(nóng)藥和化肥每年種類基本相同，病害狀況也不同于植物缺素或者藥害.柿農(nóng)反映發(fā)病區(qū)域每年都不盡相同.余糧山柿子軟腐病大量發(fā)生前其周邊建造了發(fā)電廠，是否發(fā)電廠排放的氣體誘發(fā)了該病害的發(fā)生有待于進(jìn)一步的監(jiān)測和研究？但實驗室研究表明，柿子接觸SO2氣體后出現(xiàn)成熟和腐軟的現(xiàn)象.《蘭州市大氣污染對兒童肺功能的影響研究》課題研究也表明，植物接觸SO2、O3等大氣污染物以后，體內(nèi)會產(chǎn)生應(yīng)激乙烯.

2011年在試驗的3個區(qū)域分別隨機采摘50個柿子進(jìn)行病害統(tǒng)計，結(jié)果均未發(fā)病.同時，我們委托蘭溪市環(huán)境保護監(jiān)測站在余糧山柿子種植區(qū)設(shè)點進(jìn)行為期一周的空氣中二氧化硫、氮氧化物監(jiān)測，采樣方法為連續(xù)24h采樣，監(jiān)測結(jié)果是環(huán)境空氣中二氧化硫、氮氧化物濃度符合GB3095—1996《環(huán)境空氣質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》二級標(biāo)準(zhǔn).這是否進(jìn)一步說明該病害的發(fā)生和當(dāng)?shù)丨h(huán)境條件以及氣候相關(guān)，如溫度、風(fēng)向，等等，這些因素均可導(dǎo)致柿子樹種植區(qū)SO2濃度的高低.

由于柿子軟腐病是新出現(xiàn)的一種病害，同時研究時間受到柿子生長周期的限制，這兩方面的因素給本研究帶來了一定的困難.但經(jīng)過兩年的研究分析，可以初步明確該病既非病理性病害也非生理性病害，有可能與環(huán)境因素相關(guān).

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