促紅細胞生成素變異體與脊髓損傷的相關性

顧 兵，王爍宇，李華南，王 俊，金建波

(1.江西科技師范大學生命科學學院，江西南昌 330013;2.江西中醫(yī)學院附屬醫(yī)院，江西南昌 330006)

脊髓損傷(spinal cord injury，SCI)的發(fā)病機制比較復雜，一般分為原發(fā)性損傷和繼發(fā)性損傷。前者是指脊髓直接的機械損傷，一旦發(fā)生便無法控制。具體表現(xiàn)有撞擊后持續(xù)性壓迫、撞擊后短暫性壓迫、牽張損傷和裂傷(或橫斷傷)4種形態(tài)學類型［1］。直接的損傷包括創(chuàng)傷即刻造成的神經(jīng)元大量死亡，傳導束斷裂以及血-脊髓屏障破壞所引起的脊髓內(nèi)環(huán)境失衡等，繼而引起興奮性毒性反應、自由基形成、微循環(huán)障礙、炎癥反應和細胞凋亡等一系列繼發(fā)性損害。目前SCI的治療藥物研究主要集中于糖皮質(zhì)激素、神經(jīng)節(jié)苷脂、米諾環(huán)素、Cethrin(一種Rho GTPase的抑制劑)、利魯唑(鈉離子通道抑制劑，又是谷氨酸鹽拮抗劑)以及神經(jīng)營養(yǎng)因子等一些神經(jīng)保護劑［2］，它們通過阻斷髓鞘抑制因子、抗凋亡、阻斷離子通道等途徑而起到神經(jīng)保護作用［3-4］。甲基強的松龍是唯一被美國FDA批準的標準藥物，作為常規(guī)藥物用于治療SCI始于上世紀90年代。然而，在使用的過程中常出現(xiàn)諸多不良反應和并發(fā)癥，單獨使用尚不能使已損傷的脊髓結構重建和神經(jīng)功能恢復。神經(jīng)節(jié)苷脂雖然可提高患者膀胱和腸道功能［5］，但患者的生活質(zhì)量或神經(jīng)功能沒有從根本上得到改善，使得在臨床SCI治療中受到極大限制。

最近的臨床試驗結果提示在各種神經(jīng)損傷的治療中，促紅細胞生成素(erythropoietin，EPO)可能是一種很有前途的神經(jīng)保護劑，其具有抗凋亡、調(diào)制神經(jīng)炎性反應、減輕水腫、促進神經(jīng)元和少突膠質(zhì)細胞存活，以及恢復血管完整性的功能(Fig 1)［6］。但是，長期或反復靜注EPO容易誘發(fā)紅細胞增多癥、高血壓以及血栓形成等多種血源性不良反應，甚至還會使機體產(chǎn)生中和性抗體，導致純紅細胞再生障礙性貧血［7］。這種劑量相關性毒副作用，嚴重的妨礙EPO作為SCI標準藥物的FDA認證。從這個意義上講，合成和開發(fā)具有內(nèi)源活性、能透過血腦屏障的EPO變異體具有潛在的實際應用價值。根據(jù)已有的文獻報道，EPO變異體通常有衍生物、類似物和模擬肽3種形式［8］。本文擬從EPO變異體與SCI相關性的角度，根據(jù)神經(jīng)保護機制的不同分別進行綜述，旨在為進一步開發(fā)新型EPO制劑提供科學依據(jù)。

Fig 1 Schematic of the relevance between erythropoietin variants and spinal cord injury

1 調(diào)節(jié)神經(jīng)干細胞的增殖與分化，促進神經(jīng)再生

針對原發(fā)性損傷，EPO能長期直接作用于神經(jīng)干細胞，促進受損處神經(jīng)再生。在實驗性自身免疫腦脊髓炎模型的研究中，rhEPO能夠通過增強少突膠質(zhì)細胞增殖和髓鞘的形成，促進神經(jīng)功能恢復。但是，由于EPO結構中富含糖基化，使肽鏈的穩(wěn)定性增強，導致血液中的清除速率相對較慢。去唾液酸EPO(asialoEPO)作為一種去糖基化的EPO衍生物，可減少半衰期和阻止紅細胞慢性增生等不良反應。Erbayraktar等在大鼠SCI模型上證實，asialoEPO在體內(nèi)可以生成一種半衰期很短，且有神經(jīng)保護作用的生成物。Grasso等［9］也報道asialoEPO在體內(nèi)的生成物，除了能明顯改善SCI大鼠的運動功能，還可將血漿半衰期從5～6 h縮短到不足2 min。

2 抑制神經(jīng)細胞的凋亡

損傷后出現(xiàn)大量神經(jīng)細胞的死亡不只是緣于直接損傷，還有繼發(fā)性損傷所致的細胞凋亡。通過對EPO抗凋亡機制的研究發(fā)現(xiàn)，EPO首先與EPOR結合生成二聚體激活JAK2磷?；疭TAT-5，并活化PI3-K和NF-κB?；罨腜I3-K則通過PIP3磷酸化使蛋白激酶B(AKT)激活，最終激活抗凋亡基因bcl-xL。PIP3通過AKT使BAD磷酸化而滅活，抑制了半胱天冬酶-1、3、9的激活而起到抗凋亡的作用。同時，活化的NF-κB從胞質(zhì)入核直接與DNA作用，調(diào)節(jié)凋亡抑制基因的表達，從而整體上減少神經(jīng)元的凋亡，促進神經(jīng)元的發(fā)生。此外，磷酸化的STAT-5入核又可與DNA結合，促進抑制凋亡基因bcl-xL和bcl-2轉錄，Arishima等［10］報道 EPO能夠明顯降低神經(jīng)元凋亡和caspase-3免疫反應細胞浸潤數(shù)量。Knabe等也在壓碎性的脊柱神經(jīng)根損傷模型中發(fā)現(xiàn)，EPO能夠抑制背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元的凋亡。

作為一種經(jīng)過改造的EPO衍生物，氨甲基?；疎PO(carbamylated EPO，CEPO)長期大劑量使用不會引發(fā)血源性不良反應。它是由EPOR與一個βcR亞基通過異源二聚體介導發(fā)揮其神經(jīng)保護作用，而不與造血細胞表面的受體結合。Leist等在SCI模型上證實，CEPO治療具有十分廣泛的治療時間窗，長期高劑量使用CEPO能夠明顯改善神經(jīng)功能。King等［11］也報道CEPO治療大鼠SCI，可以減小病灶區(qū)域的面積和神經(jīng)細胞的凋亡。另外，Lapchak等［12］報道通過對小鼠頸部脊髓搖擺的治療，CEPO明顯減少運動神經(jīng)元的損失，從而促進運動功能恢復。

3 減輕興奮性氨基酸介導的細胞毒性

目前研究認為，在繼發(fā)性損傷中興奮性氨基酸(EAA)具有明顯的神經(jīng)毒性作用。其作用機制主要有兩個方面:一方面，EAA大量釋放導致神經(jīng)細胞的通透性改變，Na+、H2O內(nèi)流致細胞毒性;另一方面，EAA的過度釋放可介導Ca2+大量內(nèi)流，胞內(nèi)Ca2+升高激活各種組織酶類，導致DNA、蛋白質(zhì)和磷脂降解，生成具高度反應活性的氧自由基，破壞生物膜加重SCI。同時，EPO不僅能抑制谷氨酸、NMDA、紅藻氨酸等興奮性氨基酸介導的細胞毒性損傷，而且還能減少缺氧時谷氨酸的大量釋放。Yoo等［13］在體外培養(yǎng)脊髓神經(jīng)元的研究中發(fā)現(xiàn)，EPO能夠保護神經(jīng)元免受興奮毒性導致的神經(jīng)突生長抑制EPOR表達明顯減少，進而減少了繼發(fā)性脊髓神經(jīng)元損傷。Nagańska等［14］建立大鼠脊髓興奮性谷氨酸模型，EPO處理和加入谷氨酸受體阻斷劑都能夠抑制神經(jīng)細胞壞死。另外，Brines等報道CEPO不僅可以阻止紅細胞增生，而且能抑制谷氨酸介導的細胞毒性。不僅如此，Pankratova等［15］還報道通過模擬rhEPO的C-螺旋區(qū)域氨基酸殘基(92-111)，設計并合成了一種名為Epotris的無造血活性的短肽。其不僅能促進小腦顆粒細胞軸突生長和減輕低鉀誘導的細胞毒性，而且能降低紅藻氨酸誘導的神經(jīng)毒性致小鼠死亡率。

4 調(diào)制繼發(fā)性神經(jīng)炎癥反應

EPO及其衍生物調(diào)制神經(jīng)組織炎癥反應的機制主要是通過抑制促炎性因子TNF-α、IL-6及IL-8表達，增強抗炎性因子IL-10的表達以及調(diào)控以NF-κB族為主的炎癥基因表達，增強其抗炎作用。在體外試驗中，Yuan等［16］通過自身免疫性腦脊髓炎組織培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，EPO能夠抑制免疫反應特有的T細胞增殖以及T細胞生產(chǎn)的炎癥性細胞因子。Okutan等通過大鼠急性SCI模型證實，rhEPO治療其能明顯降低caspase-3和過氧化物酶的表達水平。另外Ning等［17］建立大鼠亞急性壓迫性頸椎SCI模型，rhEPO治療能夠增強脊髓運動功能。通過ELISA法檢測發(fā)現(xiàn)可以降低IL-8、TNF-α、IL-6的水平，減少炎癥反應的發(fā)生。Mennini等［18］也報道在小鼠脊髓側索硬化癥模型中，CEPO治療可以降低運動神經(jīng)元損失，減少星形膠質(zhì)細胞和小膠質(zhì)細胞的激活。

5 抑制氧化反應

脊髓組織膜結構中含有豐富的脂質(zhì)，損傷以后細胞線粒體氧化還原酶會發(fā)生脫偶聯(lián)反應，并不斷產(chǎn)生大量氧自由基，進而攻擊細胞膜上不飽和脂肪酸，誘發(fā)過氧化反應導致膜結構的破壞，致使細胞死亡。EPO及其衍生物能夠降低脂質(zhì)過氧化，抑制氧自由基的產(chǎn)生，增加抗氧化酶的表達。脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物的增多會引發(fā)繼發(fā)性SCI。Kaptanoglu等報道EPO抑制脂質(zhì)過氧化反應和對超微結構的神經(jīng)保護作用均強于甲強龍。另外，F(xiàn)u等［19］在硬膜外壓迫與腦血管夾閉的大鼠模型上證實，EPO治療可以明顯降低脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物水平，減弱大鼠脊髓氧化性損傷。Yazihan等［20］用EPO治療大鼠SCI，1 h后大鼠體內(nèi)抗氧化酵素和過氧化氫酶活性增加，同時脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物水平降低。

6 對血管內(nèi)皮細胞的作用，促進新血管生成

EPO及其衍生物不僅能夠通過結合血管內(nèi)皮細胞上的EPO受體，調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細胞的遷移和增生，從而刺激新血管的生成，而且能夠增加缺血區(qū)域的血流量，減輕缺氧引起的血管內(nèi)皮損傷。EPO還可通過上調(diào)NO合酶的表達，舒張血管改善組織供血。Grasso等［21］報道在EPO治療大鼠SCI研究中，損傷區(qū)域神經(jīng)元和血管內(nèi)皮細胞EPO受體表達明顯增加。Ramirez等［22］報道CEPO既不能刺激內(nèi)皮祖細胞的增殖，又不增加紅細胞生成。

7 促進微循環(huán)，增加缺血區(qū)血流量

SCI以后會導致體內(nèi)多個器官的缺血，而缺血/再灌注也可導致中性粒細胞釋放過多，進而浸潤損傷區(qū)組織，加劇繼發(fā)性損傷。Cetin等［23］發(fā)現(xiàn)rhEPO能夠明顯減少急性SCI引起的局部缺血組織的損傷。S?nmez等［24］報道大鼠缺血/再灌注損傷之后，EPO治療能夠明顯增加脊髓前角運動神經(jīng)元磷酸化cAMP反應元件結合蛋白的表達。Simon等［25］在主動脈栓塞導致豬脊髓缺血/再灌注損傷，EPO治療可減輕神經(jīng)損傷和細胞凋亡。之后，Simon等又在豬主動脈栓塞4h后的脊髓缺血/再灌注損傷模型上證實，采用CEPO-FC融合蛋白治療能夠防止功能障礙和神經(jīng)損傷，并且沒有血源性不良反應，具有更好的發(fā)展前景。

總而言之，EPO變異體通過減少半衰期、與受體上的不同位點結合、模擬活性中心等一系列修飾方法，不僅保留了原有的神經(jīng)組織保護功能，而且消除了EPO治療帶來的血源性不良反應。故EPO變異體的開發(fā)日益受到神經(jīng)藥物學家的廣泛重視。然而，脊髓繼發(fā)性損傷是多種因素的交互作用，機制錯綜復雜，發(fā)揮神經(jīng)保護效應的信號轉導通路也受其它多種因子或受體因素的調(diào)控。因此，深入細致地探討EPO變異體與SCI的相關性，將會為臨床治療發(fā)現(xiàn)新的藥物靶標。

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