瑞芬太尼預(yù)處理對心力衰竭大鼠心肌的保護作用

王 斌，張 野，朱海娟，黃春霞，謝春林，吳運香，胡憲文，陳志武

(1.安徽醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院麻醉科，安徽合肥 230601;2.安徽醫(yī)科大學(xué)藥理學(xué)教研室，安徽 合肥 230032)

慢性心力衰竭是各種心血管疾病發(fā)展的終末階段，近年來呈上升趨勢，嚴重威脅人類健康。合并慢性心力衰竭的心臟手術(shù)患者常會有心肌缺血/再灌注損傷，其防治措施有待完善。缺血預(yù)處理對于心力衰竭的心臟是否有保護作用尚不清楚，而且需中斷器官供血，有駁于醫(yī)學(xué)倫理學(xué)，臨床實用性不強。瑞芬太尼(remifentanyl，REM)是臨床麻醉中常用的阿片類藥物。研究表明［1－3］，瑞芬太尼預(yù)處理可以減輕正常大鼠心肌缺血/再灌注損傷，而對慢性心力衰竭心臟缺血/再灌注是何影響尚未見報道。本實驗旨在觀察不同劑量瑞芬太尼預(yù)處理及缺血預(yù)處理對離體心衰大鼠心肌缺血/再灌注損傷的影響，并探討其可能的機制。

1 材料與方法

1.1實驗動物成年♂SD大鼠(安徽醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供)，體質(zhì)量(250±20)g，動物合格證號SCXK(皖)2005-001。

1.2藥品試劑及儀器鹽酸阿霉素(adriamycin，ADR)，批號:9QL0161(意大利 Prizer Italia S.r.l公司);鹽酸瑞芬太尼，批號:1110206(宜昌人福藥業(yè)有限責(zé)任公司公司);氯化三苯基四氮唑(TTC，美國Sigma公司);兔抗磷酸化Akt(Ser473);LDH試劑盒(南京建成生物工程研究所)。Langendorff離體心臟灌流裝置(淮北正華生物儀器設(shè)備有限公司);powerlab測壓系統(tǒng)(澳大利亞AD公司)。

1.3方法

1.3.1動物模型制備參照文獻方法［4－6］，SD 大鼠尾靜脈注射阿霉素，2 μg·g－1，共6周，累計 12 μg·g－1，制成阿霉素心衰模型。6周末大鼠腹腔注射質(zhì)量分數(shù)為10%的水合氯醛3 μl·g－1、肝素1 U·g－1抗凝后開胸取出心臟，置Langendorff灌注架，逆行灌注，灌注壓力為9.8 kPa，灌注液為K-H液(118.5 NaCl，4.7 KCl，1.2 MgSO4，1.2 KH2PO4，2.5 CaCl2，25.0 NaHCO3，11.0 Glucose，單位 mmol·L－1)。用體積分數(shù)為0.95的O2和0.05的CO2混合氣平衡，pH 7.4，溫度37℃，收集冠脈流出液。肺動脈圓錐處切開，以利于冠脈回流。于左心耳處剪一小口，通過該小口向左心室內(nèi)置入充有蒸餾水的乳膠水囊導(dǎo)管，接壓力換能器，連接Power Lab系統(tǒng)。改變水囊容積調(diào)節(jié)左心室舒張末壓(LVEDP)為0.266～1.33 kPa。用3-0絲線在左冠狀動脈前降支起始部縫一個線結(jié)，通過收集線結(jié)實現(xiàn)區(qū)域心肌缺血，缺血時表現(xiàn)為:心臟表面局部發(fā)紺、冠脈流量下降及LVDP減小。松開線結(jié)以完成心肌再灌注。全部操作完成后，心臟穩(wěn)定15min，有明顯心律失常的心臟棄之不用。

1.3.2分組隨機將阿霉素心衰心臟分為6組:Sham組、CON 組、IPC組、RPC 1組、RPC 2組、RPC 3組。RPC 1、2、3組分別在缺血前給予濃度為10、30、60 μg·L－1的瑞芬太尼 5 min 后改用不含瑞芬太尼的K-H液5 min，共3個循環(huán)。除Sham組為持續(xù)灌注165 min外，所有心臟予以30 min缺血，90 min再灌注(Fig 1)。

1.3.3血流動力學(xué)記錄基礎(chǔ)值、再灌注5、30、90 min時心率(HR)、左室發(fā)展壓(LVDP)、±dp/dtmax、冠脈流量(CF)。

1.3.4乳酸脫氫酶(LDH)分別收集基礎(chǔ)值、再灌注5、30、90 min的冠脈流出液。用試劑盒酶法測定LDH的活性。

1.3.5心肌梗死面積實驗結(jié)束后，將線結(jié)再次收緊，從主動脈內(nèi)注入質(zhì)量分數(shù)為0.25%EvenBlue。剔除非心室組織，將心肌置于－80℃冰箱中保存。將速凍后的心臟從心尖到心基部平行切5～6片，2 mm厚的心肌片，置質(zhì)量分數(shù)為1%的TTC溶液中，在37℃(pH 7.4)溫孵15 min染色后置質(zhì)量分數(shù)為10%福爾馬林固定，缺血危險區(qū)(AAR)為紅色，梗死區(qū)(IS)為白色。采用Image J圖像分析軟件測定左心室(LV)、右心室(RV)、AAR、IS的面積，面積乘以0.2cm即為各自體積。計算(LV+RV)、AAR/(LV+RV)、IS/AAR比值，以IS/AAR反映心肌梗死面積。

Fig 1 Experiment protocol

1.3.6心肌p-Akt表達水平采用Western blot法檢測。再灌注90 min后取左心室心肌組織，迅速液氮冷凍保存，標(biāo)本取齊后，剪碎心肌，加組織裂解液，冰上勻漿，4℃ 10 000×g離心5 min，取上清，BCA法測蛋白，配平，按照每 4 μl蛋白樣品加入 1 μl SDS-PAGE凝膠上電泳，電轉(zhuǎn)膜至硝酸纖維素膜上。質(zhì)量分數(shù)為5%的脫脂牛奶封閉1 h，加入一抗(p-Akt，1 ∶500稀釋;總 Akt 1 ∶500稀釋)，4 ℃水平搖床孵育過夜，TBST沖洗，加入二抗(辣根酶標(biāo)記山羊抗兔IgG，1∶10 000稀釋)，室溫振蕩孵育2 h，TBST沖洗，化學(xué)發(fā)光，凝膠成像系統(tǒng)拍攝。采用Image-pro plus 6.0版圖像分析軟件分析，以p-Akt與總Akt灰度值的比值反映目的蛋白的表達水平。

1.4統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS13.0軟件進行分析。計量資料以±s表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用配對設(shè)計資料的t檢驗。

2 結(jié)果

2.1血流動力學(xué)各組血流動力學(xué)指標(biāo)基礎(chǔ)值差異無顯著性。與Sham組相比，其余各組在再灌5、30、90 min時的 LVDP、±dp/dtmax、CF 降低(P＜0.05)。與 I/R 組相比，再灌5、30、90 min時，RPC 2組和RPC 3組的 LVDP、±dp/dtmax、CF較高(P＜0.05)，并呈劑量依賴性。而IPC組和RPC1組的各項指標(biāo)較I/R組差異無顯著性。

2.2LDH活性LDH各組LDH基礎(chǔ)值差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。與Sham組相比，其余各組在再灌5、30、90 min的LDH活性升高(P＜0.05)。與I/R組相比，RPC 2和RPC 3組在再灌5、30、90 min時的LDH活性降低(P＜0.05)。而IPC和RPC 1組的LDH的活性較I/R組無差異(Fig 2)。

Fig 2 Effect of remfentanil interventions on LDH release in coronary effluent in isolated perfused rat heart subjected to 30 min regional ischemia followed by 90 min reperfusion(±s，n=10)

2.3心肌梗死面積各組(LV+RV)、ARR、AAR/(LV+RV)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。與Sham組相比，其余各組梗死面積升高(P＜0.05)。與I/R組相比，RPC 2和RPC 3組的梗死面積較小(P＜0.05)。而IPC和RPC 1組的梗死面積較I/R組差異無顯著性(Fig 3)。

2.4p-Akt的表達p-Akt各組總Akt表達水平無差異(P＞0.05)。與 Sham組相比，其余各組p-Akt蛋白表達水平升高(P＜0.05)。與I/R組相比，RPC 2和RPC 3組p-Akt蛋白表達水平升高(P＜0.05)，而IPC和RPC1組p-Akt蛋白表達水平較I/R組差異無顯著性(Fig 4)。

3 討論

瑞芬太尼作為新的阿片類受體激動劑，其藥效強、起效迅速、副作用小、劑量容易控制、安全可靠。瑞芬太尼對μ阿片受體有強親和力，也作用于δ、κ受體。新近的研究［1－3］結(jié)果表明瑞芬太尼預(yù)處理對正常大鼠心臟的缺血/再灌注損傷可產(chǎn)生一定的保護作用。

Fig 3 Effect of remfentanil interventions on infarct size，as a percentage of the area at risk(IS/AAR)in isolated perfused rat heart subjected to 30 min regional ischemia followed by 90 min reperfusion(±s，n=6)

Fig 4 Western blot analysis of phosphor-Akt and total Akt at the 90 min of reperfusion(±s，n=4)

Tab 1 Hemodynamic parameters of each group(±s，n=10)

Tab 1 Hemodynamic parameters of each group(±s，n=10)

*P＜0.05 vs sham group，#P＜0.05 vs I/R group

Variable Group Basline Reperfusion 5 min Repe rfusion 30 min Reperfusion 90 min HR/beat·min －1Sham 252±28 242±25 238±30 229±25 I/R 248±36 234±33 225±27 228±26 IPC 256±18 230±36 229±30 222±23 RPC 10 μg·L－1 236±30 229±23 229±22 226±23 RPC 30 μg·L－1 242±37 231±40 226±35 214±34 RPC 60 μg·L－1 241±23 232±32 229±21 227±21 LVDP/kPa Sham 12.7 ±2.0 12.0 ±1.8 11.8 ±1.3 11.8 ±1.5 I/R 13.1 ±1.3 7.2 ±1.0* 6.6 ±1.1* 5.8 ±0.6*IPC 12.8 ±1.6 6.4 ±1.5* 6.4 ±0.9* 5.4 ±1.0*RPC 10 μg·L －1 12.6 ±1.9 6.7 ±1.6* 6.2 ±1.5* 5.6 ±1.6*RPC 30 μg·L －1 12.5 ±1.7 8.7 ±1.0*# 8.3 ±1.3*# 7.7 ±1.1*#RPC 60 μg·L －1 12.3 ±1.9 10.1 ±1.5*# 9.7 ±1.8*# 9.2 ±1.1*#+dp/dtmax/kPa·s－1 Sham 376±69 365±66 356±59 350±59 I/R 375±58 174±36* 156±45* 147±24*IPC 368±27 164±28* 157±25* 135±35*RPC 10 μg·L－1 344±36 172 ±44* 168±41* 157 ±51*RPC 30 μg·L－1 376±59 221±39*# 220±30*# 185±45*#RPC 60 μg·L－1 344±51 288±36*# 281±66*# 261±59*#－dp/dtmax/kPa·s－1 Sham 244±46 192±57 190±23 185±27 I/R 238±52 98±17* 94±22* 83±12*IPC 222±25 87±19* 86±17* 75±19*RPC 10 μg·L－1 221±27 89±25* 82±27* 76±26*RPC 30 μg·L－1 226±35 129±19*# 124±32*# 102±16*#RPC 60 μg·L－1 219±38 162±37*# 155±44*# 136±15*#CF/ml·min －1 Sham 20.4 ±2.1 17.0 ±1.3 16.0 ±1.2 15.2 ±1.3 I/R 20.2 ±2.3 9.6 ±1.8* 8.9 ±2.2* 8.0 ±1.8*IPC 19.6 ±3.2 10.8 ±1.6* 9.5 ±1.6* 9.0 ±1.5*RPC 10 μg·L －1 20.3 ±3.3 10.9 ±1.8* 9.4 ±2.1* 8.9 ±2.9*RPC 30 μg·L －1 22.1 ±3.6 13.7 ±2.5*# 12.8 ±2.4*# 11.7 ±2.4*#RPC 60 μg·L －1 19.2 ±2.7 15.1 ±1.7*# 14.7 ±1.8*# 12.9 ±1.6*#

1986年Murry首次描述缺血預(yù)處理即心肌在幾次短暫的缺血后可以減輕隨后較長時間的缺血后損傷［7］。而本實驗研究發(fā)現(xiàn)，在阿霉素充血性心力衰竭大鼠缺血/再灌注模型中，缺血預(yù)處理的保護作用消失了。

近年來，研究［8－9］發(fā)現(xiàn)一些麻醉藥物預(yù)處理(APC)能減輕心肌缺血/再灌注損傷。其機制是通過多種信號通路發(fā)揮心肌保護作用。其中，磷脂酰肌醇-3-激酶-絲氨酸/蘇氨酸激酶(PI3K-Akt)通路在經(jīng)過各種處理后予以激活，并發(fā)揮心肌保護作用［10］。PI3K-Akt介導(dǎo)的信號通路能夠調(diào)節(jié)細胞的分裂、分化、凋亡等活動。大量研究證實［11－12］，Akt磷酸化的變化與心肌保護效應(yīng)的變化有關(guān)。

本實驗選用的是較成熟的Langendorff離體灌注模型，排除了神經(jīng)、內(nèi)分泌等多種因素的影響，從而觀察藥物對心臟的直接作用。HR、LVDP、±dp/dtmax、CF是離體灌注模型中反映心臟功能的有效指標(biāo)。心肌梗死面積是反映心肌損傷的金標(biāo)準。當(dāng)急性心肌梗死時，冠狀動脈血供急劇減少或中斷，使相應(yīng)的心肌嚴重而持久的急性缺血導(dǎo)致心肌壞死，促使大量的心肌酶如LDH等自壞死細胞釋放，血液中相應(yīng)的酶含量明顯升高。在本實驗中，單純?nèi)毖?再灌注組心功能指標(biāo)較Sham組明顯下降，說明缺血/再灌注模型制造成功。

阿霉素是臨床上常用的抗腫瘤藥物，因其與心臟受體的高親和力而使其心臟毒性明顯［13－14］，單次或多次注射可致阿霉素心肌病，進一步發(fā)展為心力衰竭。

本實驗發(fā)現(xiàn)，在阿霉素心衰大鼠離體心肌缺血/再灌注模型，適量的瑞芬太尼預(yù)處理可以減輕心肌的收縮和舒張功能障礙、減輕心肌梗死面積、降低LDH活性。用Western blot半定量分析p-Akt，顯示瑞芬太尼預(yù)處理后使得p-Akt表達量增加，說明瑞芬太尼預(yù)處理與p-Akt的變化有一定的相關(guān)性。

綜上所述，瑞芬太尼預(yù)處理可能通過增強Akt的磷酸化來減輕阿霉素心力衰竭大鼠的心肌缺血/再灌注損傷。

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