細(xì)胞培養(yǎng)穩(wěn)定同位素標(biāo)記技術(shù)的發(fā)展及其在腦病研究中的應(yīng)用

朱 麗，劉 安，楊洪軍，陳 暢，李德鳳，吳傳鴻，高 健，李韶菁

(1.江西中醫(yī)學(xué)院，江西南昌 330006;2.中國中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所，北京 100700;3.河北大學(xué)藥學(xué)院，河北保定 071002)

腦病是指腦組織結(jié)構(gòu)和生理功能異常的疾病，腦萎縮和老年癡呆、腦癱、帕金森病、癲癇、腦血栓后遺癥和中風(fēng)偏癱，被國際醫(yī)學(xué)界并稱為5大腦病。上述腦病，究其病因雖是腦神經(jīng)和腦血管兩大因素，但其復(fù)雜性使之成為21世紀(jì)研究的熱點(diǎn)，醫(yī)學(xué)界的難題。對于腦病的研究，過去一般是采用非動(dòng)態(tài)、局部、靶向性的方法。穩(wěn)定同位素標(biāo)記(stable isotope labeling with amino acids in cell culture，SILAC)技術(shù)，作為新興的定量蛋白質(zhì)組學(xué)研究技術(shù)，可以明顯提高蛋白質(zhì)鑒定的特異性，敏感性和準(zhǔn)確性，是從系統(tǒng)角度研究復(fù)雜性問題，符合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的理念，可以全面揭示腦病的發(fā)生機(jī)制，為動(dòng)態(tài)、系統(tǒng)地定性和定量分析腦病提供了有效工具。隨著SILAC技術(shù)的不斷發(fā)展，其應(yīng)用范圍也從最初的細(xì)胞系擴(kuò)展到整體動(dòng)物水平，具體的應(yīng)用策略也在不斷完善發(fā)展，本文主要就其進(jìn)展及其在腦病研究中的應(yīng)用做一概述。

1 SILAC技術(shù)的原理與優(yōu)勢

1.1SILAC技術(shù)的基本原理SILAC技術(shù)是在細(xì)胞培養(yǎng)過程中利用穩(wěn)定同位素標(biāo)記的氨基酸結(jié)合質(zhì)譜技術(shù)對蛋白表達(dá)進(jìn)行定量分析的一種新技術(shù)。SILAC的基本原理是分別用天然同位素(輕型)或穩(wěn)定同位素(重型)標(biāo)記的必需氨基酸取代細(xì)胞培養(yǎng)基中相應(yīng)氨基酸，細(xì)胞進(jìn)行若干倍增周期后，穩(wěn)定同位素標(biāo)記的氨基酸完全參入到細(xì)胞新合成的蛋白質(zhì)中，替代了原有氨基酸，不同標(biāo)記的細(xì)胞按細(xì)胞數(shù)或蛋白量等比例混合，經(jīng)分離、純化后進(jìn)行質(zhì)譜鑒定［1－2］。SILAC技術(shù)作為一種體內(nèi)代謝標(biāo)記技術(shù)，目前標(biāo)記的氨基酸種類已擴(kuò)展到亮氨酸、精氨酸、賴氨酸、甲硫氨酸和酪氨酸［3－4］等。

1.2SILAC技術(shù)的優(yōu)勢SILAC技術(shù)較其他標(biāo)記技術(shù)具有不可替代的優(yōu)勢，它是一種體內(nèi)代謝標(biāo)記技術(shù)，標(biāo)記效率高，不需要樣品預(yù)處理，具有高通量性等突出優(yōu)勢;樣本需求量少、操作簡單、定量精確;適合于大分子量、復(fù)雜生物樣品分析，可以鑒定出更多的低豐度蛋白(包括細(xì)胞表面蛋白、細(xì)胞器特異性蛋白以及磷酸化蛋白或糖蛋白這些經(jīng)過翻譯后修飾的蛋白);體內(nèi)代謝標(biāo)記與聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDSPAGE)或色譜分離技術(shù)相結(jié)合，兼容疏水性蛋白和偏堿性蛋白，不受蛋白性質(zhì)限制，可以研究某些疏水性蛋白質(zhì)如膜蛋白、等電點(diǎn)極酸或極堿的蛋白質(zhì)以及分子量極大或極小的蛋白質(zhì);可以進(jìn)行細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的動(dòng)態(tài)變化研究。SILAC技術(shù)除在全面、精確定量差異蛋白質(zhì)組研究方面發(fā)揮作用外［5－6］，其在研究生化代謝、分子信號通路、蛋白質(zhì)翻譯后修飾［7］(如磷酸化、糖基化、甲基化、乙?；?、時(shí)空動(dòng)態(tài)變化的蛋白質(zhì)［8］和蛋白質(zhì)相互作用［9］等方面亦具有明顯優(yōu)勢。目前SILAC結(jié)合質(zhì)譜技術(shù)應(yīng)用范圍已從細(xì)胞系擴(kuò)展到亞細(xì)胞器、組織與動(dòng)物整體水平［10－12］，甚至已成功用于原代細(xì)胞培養(yǎng)［13－16］。

2 SILAC技術(shù)的發(fā)展

SILAC結(jié)合質(zhì)譜技術(shù)作為定量蛋白質(zhì)組學(xué)的一個(gè)重要方法，其應(yīng)用處于不斷發(fā)展和創(chuàng)新中。其應(yīng)用范圍從最初的細(xì)胞系擴(kuò)展到整體動(dòng)物水平。在細(xì)胞方面，從只用于傳代細(xì)胞的經(jīng)典SILAC技術(shù)，發(fā)展到可以進(jìn)行原代細(xì)胞培養(yǎng)的多重SILAC技術(shù)，進(jìn)而發(fā)展到可以用于組織樣本的超級SILAC的方法。

2.1SILAC技術(shù)在細(xì)胞方面的研究進(jìn)展

2.1.1經(jīng)典SILAC技術(shù)經(jīng)典的SILAC技術(shù)是一種完全標(biāo)記的絕對蛋白質(zhì)定量方法，穩(wěn)定同位素標(biāo)記的氨基酸與天然氨基酸化學(xué)性質(zhì)基本相同，對細(xì)胞無毒性，因而它所標(biāo)記的細(xì)胞和未標(biāo)記細(xì)胞在生物學(xué)行為上幾乎沒有差異，標(biāo)記效率可高達(dá)100%。經(jīng)典的SILAC技術(shù)是分別用含輕型穩(wěn)定同位素(天然同位素)和重型穩(wěn)定同位素標(biāo)記的必需氨基酸的培養(yǎng)基，對處于兩種不同狀態(tài)的細(xì)胞(如一種為正常細(xì)胞，另一種為病理狀態(tài)的細(xì)胞)分別進(jìn)行培養(yǎng)標(biāo)記，細(xì)胞經(jīng)至少6個(gè)細(xì)胞倍增周期被完全標(biāo)記后，將經(jīng)過輕、重型穩(wěn)定同位素標(biāo)記的兩種細(xì)胞等數(shù)量混合，將分別提取的蛋白等比例混合后經(jīng)SDS－PAGE分離，酶解提取肽，進(jìn)行質(zhì)譜檢測，通過質(zhì)譜圖上一對輕重穩(wěn)定同位素峰的比例可以反映對應(yīng)蛋白在不同狀態(tài)下的表達(dá)水平(Fig 1)。經(jīng)典的SILAC標(biāo)記方法主要用于定量分析樣品間的蛋白質(zhì)表達(dá)差異，可以應(yīng)用于檢測蛋白質(zhì)在某些生物過程中的動(dòng)態(tài)變化。

Fig 1 Experiment process of classic SILAC technology［1 －2］

2.1.2多重SILAC技術(shù)經(jīng)典的SILAC技術(shù)不適用于不可傳代或者不穩(wěn)定的細(xì)胞，多重SILAC技術(shù)是使用多組重質(zhì)氨基酸進(jìn)行標(biāo)記，是一種相對定量的不完全標(biāo)記技術(shù)［17］(Fig 2)，可用于原代細(xì)胞的培養(yǎng)。多重SILAC對同一種細(xì)胞標(biāo)記兩種以上不同的重質(zhì)氨基酸，細(xì)胞中所含重質(zhì)氨基酸比重的動(dòng)態(tài)變化反映了蛋白質(zhì)表達(dá)量的不同，是一項(xiàng)相對精度較高的質(zhì)譜定量技術(shù)。但由于SILAC技術(shù)需采用透析后血清，培養(yǎng)條件相對貧乏，為保持不可傳代細(xì)胞的生物學(xué)特性，需對細(xì)胞培養(yǎng)條件進(jìn)行摸索，使之既滿足SILAC標(biāo)記要求，同時(shí)也可以維持細(xì)胞的正常功能。

Fig 2 Multiplex SILAC［17］ technology

2.1.3超級SILAC技術(shù)超級 SILAC(Super-SILAC)技術(shù)的出現(xiàn)擴(kuò)大了SILAC技術(shù)的應(yīng)用范圍，使之既能夠測出不可傳代細(xì)胞，而且可以對多種不同類型的細(xì)胞同時(shí)測定。Super-SILAC方法是將重質(zhì)標(biāo)記的細(xì)胞樣品作為參照體系，然后將這一參照樣品與組織樣品等量混合比較，不同的組織樣品之間以參照樣品的相對量為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行比較，這一方法使SILAC在組織樣本上的應(yīng)用也得到推廣。這種Super-SILAC技術(shù)可以應(yīng)用于蛋白質(zhì)生物標(biāo)識(shí)的發(fā)現(xiàn)。Geiger等［18］用重氨基酸標(biāo)識(shí)了含有不同癌癥細(xì)胞系的混合物，用5種標(biāo)記方法混合，精確測定出人類原發(fā)性腫瘤組織中的蛋白質(zhì)(Fig 3)。

Fig 3 Heavy amino acid identity Super-SILAC technology［18］

2.2SILAC技術(shù)在整體動(dòng)物方面的研究進(jìn)展SILAC技術(shù)目前主要應(yīng)用在細(xì)胞水平，但在整體動(dòng)物方面的研究也開始進(jìn)行。體內(nèi)穩(wěn)定同位素標(biāo)記法有一個(gè)明顯優(yōu)點(diǎn)是在樣品制備的初期，蛋白質(zhì)就被標(biāo)記，從而減少了樣品間由于實(shí)驗(yàn)操作造成的差異，有利于提高定量的準(zhǔn)確度。采用純系小鼠分別飼以含重型穩(wěn)定同位素和含天然或輕型穩(wěn)定同位素氨基酸的飼料，至少傳代6代以上(保證重型穩(wěn)定同位素標(biāo)記高的結(jié)合率)。然后對動(dòng)物模型進(jìn)行藥物處理，取樣后提取蛋白質(zhì)，與重穩(wěn)定性同位素標(biāo)記的小鼠樣品進(jìn)行等量混合，利用高分辨質(zhì)譜尋找表達(dá)差異的標(biāo)志蛋白，并對鑒定的蛋白質(zhì)進(jìn)行定量，可分析和研究藥物作用機(jī)制。Kruger等［12］將組織標(biāo)記技術(shù)應(yīng)用到基因敲除小鼠上(Fig 4)，揭示了Kindlin-3蛋白在紅細(xì)胞中具有重要作用，是紅細(xì)胞發(fā)揮正常功能的必要因子。該方法是定量比較基因敲除小鼠蛋白質(zhì)組的通用工具，可利用其確定蛋白質(zhì)在復(fù)雜體內(nèi)條件下的功能。

Fig 4 Mice are fed with heavy isotope［12］

3 SILAC技術(shù)在腦病研究中的應(yīng)用

腦病是一類復(fù)雜的、難治愈的疾病，目前針對腦病的研究缺乏有效的方法。SILAC技術(shù)作為一種多靶點(diǎn)、多途徑的研究方法，能夠系統(tǒng)、動(dòng)態(tài)地分析腦病發(fā)生和發(fā)展過程中蛋白質(zhì)表達(dá)譜的變化，符合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的理念，為尋找腦中特異的蛋白標(biāo)志物，進(jìn)行疾病機(jī)制深入研究和藥物治療提供了新的思路。但目前SILAC技術(shù)在腦病研究中的應(yīng)用尚處于起步階段，相關(guān)報(bào)道較少［19］，主要有以下幾個(gè)方面:

以腦中風(fēng)神經(jīng)血管單元研究為例闡述SILAC的應(yīng)用，神經(jīng)血管單元作為一個(gè)獨(dú)立的功能單位，主要由原代神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞、微血管內(nèi)皮細(xì)胞及其基質(zhì)組成，通過不同策略的SILAC技術(shù)進(jìn)行對神經(jīng)血管單元中不同細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記:針對原代神經(jīng)元細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞采用多重SILAC標(biāo)記方法進(jìn)行標(biāo)記(multiplex SILAC labeling)，微血管內(nèi)皮細(xì)胞系為可傳代細(xì)胞，采用經(jīng)典SILAC技術(shù)。然后對3種細(xì)胞加入損傷因素和藥物干預(yù)，對處理的不同標(biāo)記的細(xì)胞等量混合，進(jìn)行LC-MS分析，鑒定其中的蛋白質(zhì)并進(jìn)行定量。還可采用Super-SILAC技術(shù)直接提取腦組織，用重氨基酸標(biāo)識(shí)神經(jīng)血管單元里不同細(xì)胞的混合物，在組織水平上鑒定蛋白質(zhì)。使用神經(jīng)血管單元作為體外研究腦缺血的模型，有利于有效地將SILAC定量技術(shù)與腦卒中微環(huán)境的研究結(jié)合起來，而且利用這個(gè)模型發(fā)現(xiàn)的新靶標(biāo)可以進(jìn)一步在整體動(dòng)物模型中進(jìn)行驗(yàn)證，形成了完整的腦卒中相關(guān)細(xì)胞的定量蛋白質(zhì)組學(xué)SILAC研究策略。

Yang等［20］使用SILAC技術(shù)分析糖氧剝奪后sumo3表達(dá)的改變，找到了一些可能與sumo相關(guān)的信號通路和恢復(fù)缺血性應(yīng)力的通路。

阿爾采末癥(Alzheimer’s disease，AD)是由于腦內(nèi)神經(jīng)結(jié)構(gòu)發(fā)生病變而引起的老年性癡呆癥，有文獻(xiàn)證明小膠質(zhì)細(xì)胞可能在其發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要作用。Liu等［21］利用SILAC技術(shù)探討AD發(fā)病機(jī)制，通過內(nèi)毒素預(yù)處理1h的小膠質(zhì)細(xì)胞與空白組進(jìn)行比較，確定了77種分泌蛋白，其中28種與細(xì)胞溶酶體相關(guān)，13種溶酶體蛋白表達(dá)差異有顯著性，證明了小膠質(zhì)細(xì)胞釋放的一些溶酶體酶可能參與神經(jīng)元損傷過程。應(yīng)用SILAC技術(shù)能夠系統(tǒng)地解析疾病涉及信號網(wǎng)絡(luò)，預(yù)測某些關(guān)鍵信號蛋白，為深入的功能研究指出方向。

帕金森病(Parkinson’s disease，PD)是一種嚴(yán)重影響患者活動(dòng)能力的中樞神經(jīng)系統(tǒng)慢性疾病，目前公認(rèn)其病因是神經(jīng)細(xì)胞的退行性變，大腦黑質(zhì)神經(jīng)元數(shù)量減少，多巴胺合成不足，但其深入的病機(jī)尚不清楚。Jin等［22］利用SILAC技術(shù)比較魚藤酮對線粒體蛋白質(zhì)(多巴胺)的影響，確定了1 722個(gè)蛋白質(zhì)，在950個(gè)線粒體蛋白質(zhì)中，在魚藤酮處理之后有110個(gè)有相對豐度的明顯差異變化。進(jìn)一步表明這些蛋白質(zhì)可能闡明PD發(fā)病機(jī)制。

4 展望

中藥具有多靶點(diǎn)、多向調(diào)節(jié)、防治結(jié)合的特點(diǎn)，雖早已被廣泛應(yīng)用于腦病臨床治療，但由于其成分復(fù)雜，缺乏有效研究手段，作用機(jī)制無法闡釋清楚。將SILAC這種系統(tǒng)、高通量的定量蛋白質(zhì)組技術(shù)應(yīng)用于復(fù)雜腦病的研究，并將其作為治療腦病中藥研究的手段，探索適合中醫(yī)藥特點(diǎn)的新研究模式，是一個(gè)相對新的思路，但如何聯(lián)合不同策略的SILAC技術(shù)，有效并更適合應(yīng)用于神經(jīng)系統(tǒng)疾病如腦中風(fēng)、AD、PD的研究，更深入地闡明中藥復(fù)方的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)、多成分交互作用機(jī)制及其組方的科學(xué)內(nèi)涵，仍需進(jìn)一步探討。

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