坦布蘇病毒感染DF-1細胞入侵途徑的初步研究

章麗嬌 李銀 劉青濤 劉宇卓 韓凱凱 趙冬敏 黃欣梅 楊婧

摘要：坦布蘇病毒是我國新發(fā)易引起家禽出現(xiàn)嚴重產(chǎn)蛋下降和中樞神經(jīng)系統(tǒng)異常的重要傳染病病原。通過特異性的化學阻斷劑預處理DF-1細胞，噬斑計數(shù)法檢測其對病毒滴度的影響，相對熒光定量RT-PCR檢測其對病毒核酸表達的影響，并對影響顯著的結果進行吸附和內(nèi)吞試驗。結果顯示，網(wǎng)格蛋白抑制劑氯丙嗪和動力蛋白抑制劑dynasore可顯著降低病毒滴度和病毒核酸表達，且主要作用于內(nèi)吞過程，對病毒吸附無影響。膽固醇抽提劑甲基-β-環(huán)糊精、小窩蛋白抑制劑genistein及胞吞抑制劑EIPA對病毒滴度無明顯影響。結果表明，坦布蘇病毒入侵DF-1細胞依賴于網(wǎng)格蛋白和動力蛋白，而不依賴于膽固醇、小窩蛋白和胞吞作用。

關鍵詞：坦布蘇病毒;DF-1細胞;入侵

中圖分類號：S852.65+7?? 文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2021）15-0155-04

收稿日期：2021-03-14

基金項目：江蘇省自然科學基金（編號：BK20180303）;國家自然科學基金（編號：31802200）。

作者簡介：章麗嬌（1987—），女，浙江德清人，博士，助理研究員，主要從事家禽病毒分子生物學研究。E-mail：zhang62810003@126.com。

坦布蘇病毒隸屬黃病毒科黃病毒屬，于2010年4月首先在我國東南沿海地區(qū)養(yǎng)鴨場暴發(fā)并迅速蔓延至我國大部分主要水禽養(yǎng)殖地區(qū)[1-2]?；疾∪怿喼饕憩F(xiàn)為采食下降和生長緩慢，患病蛋鴨主要表現(xiàn)為產(chǎn)蛋下降，嚴重者均可出現(xiàn)共濟失調(diào)、癱瘓等中樞神經(jīng)系統(tǒng)癥狀，發(fā)病率高達100%，死亡率為5%～30%[3]。迄今為止，病毒感染宿主范圍十分廣泛，不僅包括不同品種的家養(yǎng)鴨，還蔓延至鵝、雞、肉鴿甚至麻雀等其他禽類[4-7]。我國是水禽生產(chǎn)大國，坦布蘇病毒的暴發(fā)和流行對水禽養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失。

病毒感染宿主細胞是一個復雜的過程，其中入侵是病毒對靶細胞建立有效感染的第一步，包括病毒與細胞受體結合、內(nèi)吞與脫殼。研究報道，病毒可通過多種內(nèi)吞方式進入宿主細胞，主要包括網(wǎng)格蛋白介導的內(nèi)吞途徑、小窩蛋白介導的內(nèi)吞途徑、巨胞飲作用及其他尚未明確的內(nèi)吞機制等[8]。同時，各種宿主細胞元件諸如膽固醇、動力蛋白、Rab5等能夠被病毒利用參與內(nèi)吞過程。不同病毒入侵不同宿主細胞的方式是多樣化的。比如，乙型腦炎病毒通過網(wǎng)格蛋白介導的內(nèi)吞途徑入侵C6/36和 HeLa 細胞[9-10]，通過小窩蛋白介導的內(nèi)吞途徑入侵神經(jīng)細胞[11];而西尼羅病毒則依賴脂笩入侵神經(jīng)細胞和HeLa細胞[12]。

坦布蘇病毒感染宿主廣，有組織泛嗜性，體外感染鴨胚成纖維細胞（DEF）、雞胚成纖維細胞（CEF）、幼倉鼠腎細胞（BHK-21）、非洲綠猴腎細胞（Vero）及C6/36蚊子細胞等多種細胞系。入侵作為病毒感染的首要環(huán)節(jié)，與病毒泛嗜性密切相關。研究入侵對病毒致病機制的深入理解具有重要意義。目前，對坦布蘇病毒入侵方面的研究報道較少，故本研究利用針對不同內(nèi)吞途徑的特異性化學阻斷劑初步探討坦布蘇病毒入侵DF-1細胞的機制，為深入闡明坦布蘇病毒的入侵機制提供試驗依據(jù)，也為病毒的防控提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 毒株和細胞

試驗所用坦布蘇病毒JS804株和DF-1細胞均由筆者所在實驗室保存。

1.2 主要試劑和耗材

氯丙嗪（CPZ）、dynasore、甲基-β-環(huán)糊精（MβCD）、genistein和EIPA均，購自Sigma公司;胎牛血清，購自Hyclone公司;DMEM培養(yǎng)基，購自Gibco公司;RNA抽提試劑盒，購自Axygen公司;MLV反轉(zhuǎn)錄酶，購自Takara公司;SYBR qPCR Master Mix，購自諾唯贊公司;CCK-8試劑盒，購自碧云天生物技術公司。

1.3 細胞預處理和病毒感染試驗

采用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng) DF-1 細胞接種至12孔細胞培養(yǎng)板，置37? ℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)約24 h。待細胞密度長至90%時，吸棄培養(yǎng)液，用滅菌PBS洗滌3次，分別加入不同入侵途徑阻斷劑（甲基-β-環(huán)糊精（MβCD）、氯丙嗪（CPZ）、genistein、dynasore和EIPA），同時設不處理空白對照，作用1 h后，以MOI=0.01的劑量接種坦布蘇病毒，37 ℃孵育1 h，吸棄接種液，每孔加入1.5 mL含2%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，置37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。感染 24 h 后收集細胞病毒液，進行病毒滴度和核酸檢測。

1.4 細胞預處理和病毒吸附及內(nèi)吞試驗

按“1.3”節(jié)步驟準備12孔板DF-1單層細胞并用藥物進行預處理，以MOI=5的劑量接種坦布蘇病毒，4 ℃孵育1 h，或吸棄接種液，用預冷的滅菌PBS洗滌3次后直接收集細胞進行病毒核酸檢測（吸附試驗）;或?qū)⒔臃N細胞移置37 ℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)2 h后吸棄接種液，預冷滅菌PBS洗滌3次，用 1 mg/mL 蛋白酶K在4 ℃條件下作用45 min后收集細胞進行病毒核酸檢測（內(nèi)吞試驗）。

1.5 病毒滴度測定

用噬斑計數(shù)法進行病毒滴度的測定。用預冷的DMEM基礎液將收集樣品進行10倍系列倍比稀釋，接種至預先制備的12孔板單層BHK-21細胞，置 37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育1 h，吸棄孔內(nèi)接種液，每孔加入1.5 mL含4% FBS的2%低熔點瓊脂與 2×DMEM基礎培養(yǎng)液等體積混合的上層瓊脂培養(yǎng)基，4 ℃放置10 min，使低熔點瓊脂冷卻，置 37 ℃、5% CO2細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)72 h，每孔加入 0.5 mL 終濃度為0.02%中性紅染液至上層瓊脂，37 ℃放置12 h后觀察結果，記錄噬斑數(shù)，計算病毒滴度。

1.6 相對熒光定量PCR檢測病毒核酸表達

按RNA抽提試劑盒說明書提取收集細胞樣品RNA并利用MLV反轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA。以獲取的cDNA為模板，用SYBR Green染料法進行相對熒光定量PCR的擴增。坦布蘇病毒擴增上下游引物分別為：5′-GTGAGATCTTACTGCTATGAG-3′和5′-ACTTGGCACATGTC TGTATGC-3′;細胞內(nèi)參基因actin擴增上下游引物分別為：5′-TTGGAGGCTCTATCCTGG-3′和5′-TAGAAGCATTTGCGGTGG-3′。反應條件為：95 ℃預變性3 min;95 ℃ 變性10 s，60 ℃ 退火30 s，40個循環(huán)。用2-ΔΔCT法計算病毒基因的相對表達量。

1.7 細胞活性試驗

用CCK-8法檢測藥物對細胞活性的影響。制備96孔板DF-1單層細胞，用不同濃度的藥物 37 ℃ 處理2 h，每孔加入10 μL CCK-8溶液，設置加處理藥物、CCK-8溶液和相應培養(yǎng)液但不加細胞的孔作為空白對照，孵育1 h后，測定450 nm處的吸光度。

2 結果與分析

2.1 坦布蘇病毒入侵DF-1細胞依賴網(wǎng)格蛋白

為觀察網(wǎng)格蛋白對坦布蘇病毒感染DF-1細胞的影響，本試驗分別用不同濃度的網(wǎng)格蛋白抑制劑CPZ（0.0、12.5、25.0、50.0 μmol/L）預處理細胞后感染病毒，用噬斑計數(shù)法測定感染24 h后的病毒滴度，同時用qRT-PCR測定病毒核酸表達。由圖1可知，與對照組相比，抑制劑CPZ處理細胞后可顯著降低病毒滴度和病毒核酸相對表達量，并且呈劑量依賴性;吸附和內(nèi)吞試驗結果顯示，CPZ可顯著抑制病毒的內(nèi)吞，對病毒的吸附無明顯影響。提示坦布蘇病毒通過網(wǎng)格蛋白依賴內(nèi)吞途徑入侵DF-1細胞。

2.2 坦布蘇病毒入侵DF-1細胞不依賴于小窩蛋白

為觀察小窩蛋白對坦布蘇病毒感染DF-1細胞的影響， 本試驗分別使用不同濃度的小窩蛋白抑制劑genistein（0、100、200、400 μmol/L）預處理細胞后感染病毒，用噬斑計數(shù)法測定感染24 h后的病毒滴度。由圖2可知，與對照組相比，不同濃度genistein處理細胞后，病毒的滴度無顯著差異，表明坦布蘇病毒入侵DF-1細胞不依賴小窩蛋白。

2.3 坦布蘇病毒入侵DF-1細胞不依賴于膽固醇

為觀察細胞膜膽固醇對坦布蘇病毒感染DF-1細胞的影響，本試驗分別用不同濃度的膽固醇抽提劑MβCD（0.0、2.5、5.0、7.5、10.0 mmol/L）預處理細胞后感染病毒，用噬斑計數(shù)法測定感染24 h后的病毒滴度。由圖3可知，與對照組相比，不同濃度MβCD處理細胞后，病毒的滴度無顯著差異，表明坦布蘇病毒入侵DF-1細胞不依賴于膽固醇。

2.4 坦布蘇病毒入侵DF-1細胞依賴于動力蛋白

為觀察動力蛋白對坦布蘇病毒感染DF-1細胞的影響，本試驗分別用不同濃度的動力蛋白抑制劑dynasore（0、20、50、100 μmol/L）預處理細胞后感染病毒，用噬斑計數(shù)法測定感染24 h后的病毒滴度，同時用qRT-PCR測定病毒核酸表達。由圖4可知，與對照組相比，抑制劑dynasore處理細胞后可顯著降低病毒滴度和病毒核酸相對表達量，并且呈劑量依賴性。吸附和內(nèi)吞試驗結果顯示，dynasore可顯著抑制病毒的內(nèi)吞，對病毒的吸附無明顯影響。以上試驗結果表明，坦布蘇病毒入侵DF-1細胞依賴于動力蛋白。

2.5 坦布蘇病毒入侵DF-1細胞不依賴于胞吞途徑

為觀察坦布蘇病毒入侵DF-1細胞是否依賴于胞吞途徑，試驗分別使用不同濃度的胞吞途徑抑制劑EIPA（0、10、20、50 μmol/L）預處理細胞后感染病毒，用噬斑計數(shù)法測定感染24 h后的病毒滴度。由圖5可知，與對照組相比，不同濃度EIPA處理細胞后，病毒的滴度無顯著差異，表明坦布蘇病毒入侵DF-1細胞不依賴于胞吞途徑。

3 討論與結論

入侵是病毒進入宿主細胞并建立有效感染的第一步。目前，研究表明，大多數(shù)動物病毒能夠利用宿主細胞的多種內(nèi)吞方式完成入侵過程。其中網(wǎng)格蛋白依賴的內(nèi)吞是一種經(jīng)典的內(nèi)吞途徑，也是許多病毒進入細胞的主要途徑，如乙腦病毒入侵BHK-21細胞[13]，豬瘟病毒入侵ST細胞[14]，牛腹瀉病毒入侵MDBK細胞[15]等。通常情況下，病毒與細胞受體結合后招募網(wǎng)格蛋白，使包膜內(nèi)陷成包被小凹，隨之形成骨架為網(wǎng)格蛋白的包被囊泡，病毒被包裹其中。在動力蛋白參與下，囊泡頸部膜斷裂，囊泡脫離細胞膜，將病毒遞送到內(nèi)體中[8]。小窩依賴的內(nèi)吞也是病毒入侵細胞的常見途徑，比如乙腦病毒入侵神經(jīng)細胞[11]，埃博拉病毒入侵骨肉瘤細胞[16]等。細胞膜上的小窩由膽固醇、鞘脂及小窩蛋白組成，也是脂笩的一種形式。小窩依賴的內(nèi)吞過程同樣需要動力蛋白的參與，使內(nèi)陷的小泡脫離胞膜[8]。此外，巨胞飲作為細胞的一種重要生理過程，一般由生長因子誘導引起細胞膜褶皺形成巨飲胞體，主要介導某些大分子物質(zhì)的內(nèi)吞，也可以幫助某些病毒完成入胞過程，比如牛痘病毒、單純皰疹病毒1型等[8]。同時，病毒的入侵需要諸多宿主元件的參與，除上述動力蛋白外，還有肌動蛋白、酪氨酸激酶、膽固醇等等。文獻報道，膽固醇在黃病毒的入侵過程中發(fā)揮重要作用，比如甲基-β-環(huán)糊精去除胞膜膽固醇可顯著抑制西尼羅病毒和登革熱病毒在一些哺乳動物細胞上的入侵效率[17]。本研究發(fā)現(xiàn)，分別用網(wǎng)格蛋白組裝抑制劑氯丙嗪和動力蛋白抑制劑dynasore預處理DF-1細胞后，均能顯著抑制坦布蘇病毒的感染，且主要作用于病毒的內(nèi)吞過程，而小窩蛋白抑制劑、膽固醇抽提劑和巨胞飲抑制劑處理細胞則對病毒的感染無明顯影響，提示坦布蘇病毒主要利用網(wǎng)格蛋白介導的內(nèi)吞途徑入侵DF-1細胞，并依賴于動力蛋白。

病毒入侵是一個復雜而多樣化的過程，病毒可同時利用多種內(nèi)吞途徑進入宿主細胞，同一病毒可通過不同途徑進入不同細胞，不同病毒在同一細胞上的入侵方式也各有差異。本試驗初步研究了坦布蘇病毒在DF-1細胞上的入侵途徑，但對于病毒為何選擇這種途徑與如何利用這種途徑的具體機制以及可能存在的其他入侵途徑等需要進一步深入研究。

參考文獻：

[1]曹貞貞，張 存，黃 瑜，等. 鴨出血性卵巢炎的初步研究[J]. 中國獸醫(yī)雜志，2010，46（12）：3-6.

[2]Su J，Li S，Hu X，et al. Duck egg-drop syndrome caused by BYD virus，a new Tembusu-related flavivirus[J]. PLoS One，2011，6（3）：e18106.

[3]Cao Z Z，Zhang C，Liu Y E，et al. Tembusu virus in ducks，China[J]. Emerging Infectious Diseases，2011，17（10）：1873-1875.

[4]Liu M，Chen S，Chen Y，et al. Adapted tembusu-like virus in chickens and geese in China[J]. Journal of Clinical Microbiology，2012，50（8）：2807-2809.

[5]Chen S，Wang S，Li Z，et al. Isolation and characterization of a Chinese strain of Tembusu virus from Hy-Line Brown layers with acute egg-drop syndrome in Fujian，China[J]. Archives of Virology，2014，159（5）：1099-1107.

[6]Yun T，Ye W，Ni Z，et al. Identification and molecular characterization of a novel flavivirus isolated from Pekin ducklings in China[J]. Veterinary Microbiology，2012，157（3/4）：311-319.

[7]Tang Y，Diao Y，Yu C，et al. Characterization of a tembusu virus isolated from naturally infected house sparrows （passer domesticus） in northern China[J]. Transboundary and Emerging Diseases，2013，60（2）：152-158.

[8]Mercer J，Schelhaas M，Helenius A. Virus entry by endocytosis[J]. Annual Review of Biochemistry，2010，79：803-833.

[9]Chuang C K，Yang T H，Chen T H，et al. Heat shock cognate protein 70 isoform D is required for clathrin-dependent endocytosis of Japanese encephalitis virus in C6/36 cells[J]. The Journal of General Virology，2015，96（4）：793-803.

[10]Khasa R，Vaidya A，Vrati S，et al. Membrane trafficking RNA interference screen identifies a crucial role of the clathrin endocytic pathway and ARP2/3 complex for Japanese encephalitis virus infection in HeLa cells[J]. The Journal of General Virology，2019，100（2）：176-186.

[11]Zhu Y Z，Xu Q Q，Wu D G，et al. Japanese encephalitis virus enters rat neuroblastoma cells via a pH-dependent，dynamin and caveola-mediated endocytosis pathway[J]. Journal of Virology，2012，86（24）：13407-13422.

[12]Medigeshi G R，Hirsch A J，Streblow D N，et al. West Nile virus entry requires cholesterol-rich membrane microdomains and is Independent of alphavbeta3 integrin[J]. Journal of Virology，2008，82（11）：5212-5219.

[13]Liu C C，Zhang Y N，Li Z Y，et al. Rab5 and Rab11 are required for clathrin-dependent endocytosis of Japanese encephalitis virus in BHK-21 cells[J]. Journal of Virology，2017，91（19）：e01113-e01117.

[14]梁武龍，方 佳，林 鷙，等. 豬瘟病毒通過網(wǎng)格蛋白介導的內(nèi)吞途徑入侵ST細胞[J]. 畜牧獸醫(yī)學報，2017，48（1）：140-149.

[15]Lecot S，Belouzard S，Dubuisson J，et al. Bovine viral diarrhea virus entry is dependent on clathrin-mediated endocytosis[J]. Journal of Virology，2005，79（16）：10826-10829.

[16]Marjom ki V，Pieti inen V，Matilainen H，et al. Internalization of echovirus 1 in caveolae[J]. Journal of Virology，2002，76（4）：1856-1865.

[17]Osuna-Ramos J F，Reyes-Ruiz J M，Del ??R. The role of host cholesterol during flavivirus infection[J]. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology，2018，8：388.