浙江鎮(zhèn)海潮間帶沉積物中可培養(yǎng)微生物初步研究

鄭 瑩，霍穎異

（1.中國(guó)大洋礦產(chǎn)資源研究開(kāi)發(fā)協(xié)會(huì)，北京 100080；2.國(guó)家海洋局 第二海洋研究所，國(guó)家海洋局 海洋生態(tài)系統(tǒng)與生物地球化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州 310012）

0 引言

浙江省海域面積26萬(wàn)km2且海島眾多，海岸線全長(zhǎng)6 486km，居全國(guó)首位［1］。浙江省海域?qū)儆趤啛釒А貛夂?，利于海洋生物的繁殖和生長(zhǎng)，是生產(chǎn)力較高的海域，其獨(dú)特的海洋環(huán)境蘊(yùn)藏著豐富的海洋微生物資源。然而目前關(guān)于浙江沿海沉積物微生物多樣性的報(bào)道還較少。2008年，霍穎異 等［2］采用可培養(yǎng)和非培養(yǎng)相結(jié)合的方法調(diào)查了浙江蒼南近海沉積物的細(xì)菌多樣性；其他還有些相關(guān)研究報(bào)道多采用平板計(jì)數(shù)或生理生化鑒定的調(diào)查方法［3－4］，未能真實(shí)反映樣品中微生物的分類(lèi)地位和多樣性。

本研究采用純培養(yǎng)方法和基于16SrRNA基因序列，調(diào)查和分析浙江省鎮(zhèn)海潮間帶沉積物的可培養(yǎng)細(xì)菌群落組成，不但豐富了近海海洋細(xì)菌種質(zhì)資源，初步探討了海洋細(xì)菌群落在生態(tài)系統(tǒng)中作用，對(duì)近海細(xì)菌資源開(kāi)發(fā)也具有一定的指導(dǎo)意義。

1 材料和方法

1.1 樣品采集

2008年6月，對(duì)浙江省鎮(zhèn)海潮間帶沉積物插管取樣，將柱狀沉積物樣品進(jìn)行1cm間隔分層分裝，短期4℃陰暗保存，運(yùn)抵實(shí)驗(yàn)室后即開(kāi)展相關(guān)工作。本文采用表層0～1cm層沉積物開(kāi)展研究。

1.2 菌株的分離與保藏

采用2216寡營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基分離并純化海洋細(xì)菌。2216寡營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基配方為（L－1）：NaCl 19.45g，MgCl2·6H2O 12.6g，MgSO4·7H2O 6.64g，CaCl21.8g，KCl 0.55g，NaHCO30.16g，KBr 0.08g，SrCl2·6H2O 0.057g，H3BO30.022g，Na2SiO3·9H2O 0.093g，NaF 0.002 4g，NH4NO30.002 4g，Na2HPO40.008g，蛋白胨0.5g，酵母抽提物0.1g；用5mol·L－1NaOH將pH值調(diào)至7.2。固體培養(yǎng)基另加20g／L瓊脂粉。

取沉積物樣品約0.5g，放入3mL培養(yǎng)基鹽溶液中。振蕩15min后，使其自然沉降，取上清液10倍梯度稀釋?zhuān)瑢?02、103和104倍稀釋的溶液涂布于平板。每個(gè)梯度涂布3塊平板，分別置于25℃和37℃培養(yǎng)。待長(zhǎng)出明顯菌落后，挑取單菌落并反復(fù)劃線純化菌株。菌株培養(yǎng)液中加入20%（v／v）的甘油混勻，保藏于－80℃。

1.3 PCR擴(kuò)增16SrRNA基因序列

取1mL對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的菌液，以12 000r／min離心1min獲得菌體，并加入200μL無(wú)菌水懸浮菌體。放置沸水浴30min，破細(xì)胞后，冰浴2min，以12 000r／min離心2min并取上清液為PCR模板。PCR擴(kuò) 增 引 物 為 27F（5’－AGAGTTTGATCCTGGCTCAG－3’）和 1492R （5’－GGTTACCTTGTTACGACTT－3’）。50μL反應(yīng)體系為 H2O 41μL，10×PCR buffer 5μL，dNTP 0.5μL，引 物 27F 1μL，引物1492R1μL，模板DNA（50ng／μL）1μL，Taq酶（TaKaRa）0.5μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5min；94℃變性45s，55℃退火45s，72℃延伸90s，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min。用1%（w／v）的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)產(chǎn)物后，送至深圳華大基因研究院測(cè)序。

1.4 16SrRNA基因序列分析

將獲得的16SrRNA基因序列通過(guò)EzTaxone［5］（http：//eztaxon－e.ezbiocloud.net／）在線服務(wù)進(jìn)行比對(duì)，獲取相似度較高的近緣物種菌株信息及序列。采用MEGA 5［6］軟件中Clustal W程序進(jìn)行多序列匹配排列，并基于Neighbor－Joining算法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

2 結(jié)果

在25℃和37℃下培養(yǎng)后，細(xì)菌在2216寡營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)表現(xiàn)為直徑0.3～0.5mm的圓形或不規(guī)則圓形菌落，表面平整、隆起或呈臍狀突起，顏色呈透明、白色、黃色、紅色和橙色等。根據(jù)菌落形態(tài)特征篩選菌株并分離純化，共獲得39株細(xì)菌。

16SrRNA基因序列分子鑒定結(jié)果（表1）表明，這些菌株分別屬于厚壁菌門(mén)Firmicutes（20株，51.3%）、變形桿菌門(mén)Proteobacteria（12株，30.8%）、擬桿菌門(mén) Bacteroidetes（6株，15.4%）和放線菌門(mén)Actinobacteria（1株，2.6%）4個(gè)類(lèi)群。厚壁菌門(mén)的菌株歸屬于芽孢桿菌屬Bacillus、鳥(niǎo)氨酸芽孢桿菌屬Ornithinibacillus和海洋芽孢桿菌屬Thalassobacillus；變形桿菌門(mén)的菌株歸屬于α－變形桿菌綱Alphaproteobacteria的紅環(huán)菌屬Roseicyclus、紅細(xì)菌屬Rhodobacter、赤桿菌屬Erythrobacter、簡(jiǎn)納西氏菌屬Jannaschia和魯杰氏菌屬Ruegeria以及γ－變形桿菌綱Gammaproteobacteria的不動(dòng)桿菌屬Acinetobacter和假單胞菌屬Pseudomonas；擬桿菌門(mén)的菌株歸屬于嗜冷菌屬Algoriphagus和黃桿菌科Flavobacteriaceae；而放線菌門(mén)的菌株歸屬于戈登氏菌屬Gordonia。

表1 鎮(zhèn)海潮間帶沉積物分離細(xì)菌16SrRNA基因序列同源性比較結(jié)果Tab.1 Homology comparison of 16SrRNA gene sequences of the bacteria isolated from the tidal flat sediment of Zhenhai

續(xù)表1

分離菌株16SrRNA基因序列的系統(tǒng)發(fā)育分析（圖1）及同源性比較結(jié)果（表1）表明，菌株與相關(guān)已知物種標(biāo)準(zhǔn)菌株的16SrRNA基因序列相似性為93.6%～100.0%，說(shuō)明部分菌株與其系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系密切的相關(guān)菌株之間存在一定的遺傳差異。研究發(fā)現(xiàn)一些菌株與已報(bào)道標(biāo)準(zhǔn)菌株間的相似度較低，如菌株ZH09與RobiginitaleabiformataHTCC2501T（93.6%）、ZH15 與RhodobacteraestuariiJA29T（97.1%）、ZH17 與RuegeriapomeroyiDSS－3T（97.2%）、ZH38 與AcinetobacterindicusA648T（96.8%），它們可能代表了一些新的分類(lèi)單元。特別是菌株ZH09與已報(bào)道標(biāo)準(zhǔn)菌株的16SrRNA基因序列相似性皆小于94%，可能代表了一個(gè)新屬。目前，針對(duì)這些特色菌株的新種鑒定工作正在進(jìn)行，其中，已經(jīng)以菌株ZH17為標(biāo)準(zhǔn)菌株建立了Ruegeria屬的一個(gè)新種Ruegeriamarina［7］。

3 討論

本研究針對(duì)采集自浙江鎮(zhèn)海潮間帶的沉積物樣品，采用純培養(yǎng)方法以及基于16SrRNA基因序列的分析，分離并鑒定了39株海洋細(xì)菌。分析結(jié)果表明，芽孢桿菌為鎮(zhèn)海潮間帶沉積物中可培養(yǎng)細(xì)菌的優(yōu)勢(shì)類(lèi)群，占菌株總數(shù)的46.2%。芽孢桿菌為異養(yǎng)細(xì)菌，它們的大量出現(xiàn)表明該海域環(huán)境中有機(jī)質(zhì)營(yíng)養(yǎng)較為豐富。而芽孢桿菌的優(yōu)勢(shì)種群地位在其他近岸沉積物研究中亦有報(bào)道，如孫風(fēng)芹 等［8］對(duì)南海南沙海域沉積物中可培養(yǎng)微生物的研究發(fā)現(xiàn)，在22個(gè)研究站點(diǎn)中，10個(gè)站點(diǎn)的分離菌株半數(shù)以上為芽孢桿菌；GONTANG et al［9］對(duì)西太平洋群島沉積物的可培養(yǎng)微生物的研究表明，芽孢桿菌是一類(lèi)可培養(yǎng)優(yōu)勢(shì)類(lèi)群，占分離菌株總數(shù)的34.4%。且本研究中75%（20株中的15株）的芽孢桿菌菌株與陸源細(xì)菌而非海洋來(lái)源細(xì)菌有較近的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系（圖1），說(shuō)明這些近海海域的微生物可能來(lái)源于陸地。值得注意的是，菌株ZH04和ZH55與砷耐受菌株BacillusindicusSd／3T［10］的相似性為99.9%；菌株 ZH41和 ZH43與BacillussubterraneusDSM 13966T的相似性為99.7%，該菌株可還原 Fe（III）和 Mn（IV）［11］；菌株ZH56與Bacillusthioparans的相似性最高，該種內(nèi)菌株U3可氧化 Mn（II）并吸附Cd、Zn、Cu和Pb等重金屬［12－13］。發(fā)現(xiàn)這些與重金屬氧化還原和吸附相關(guān)的菌株，從某種程度上反映了近年來(lái)重金屬?gòu)U水大量排放導(dǎo)致的沿海海域重金屬污染，也說(shuō)明了陸地人類(lèi)活動(dòng)對(duì)近海海域生態(tài)環(huán)境的影響。這些菌株可能可以在日后應(yīng)用于重金屬污染的土壤修復(fù)和廢水處理。

圖1 鎮(zhèn)海潮間帶沉積物可培養(yǎng)細(xì)菌16SrRNA基因序列系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.1 Phylogenetic tree of 16SrRNA gene sequences of strains from the tidal flat sediment of Zhenhai

α－變形桿菌為該樣品中可培養(yǎng)細(xì)菌的第二大優(yōu)勢(shì)類(lèi)群，占菌株總數(shù)的25.6%，其中又以Roseobacter類(lèi)群菌株為主，包括 ZH40、ZH15、ZH32、ZH18、ZH36、ZH39、ZH50和ZH17八個(gè)菌株。Roseobacter類(lèi)群細(xì)菌是海洋浮游微生物中含量最為豐富的類(lèi)群之一，有研究顯示，大洋的表層海水中，十分之一的細(xì)菌細(xì)胞屬于Roseobacter類(lèi)群，而在近海海水中，該類(lèi)群的比例達(dá)到五分之一［14－15］。Roseobacter類(lèi)群為變形桿菌門(mén)Proteobacteriaα－變形桿菌綱 Alphaproteobacteria紅桿菌目Rhodobacterales紅桿菌科Rhodobacteraceae中的一些海洋浮游細(xì)菌，包括玫瑰桿菌屬Roseobacter、魯杰氏菌屬Ruegeria、簡(jiǎn)納西氏菌屬Jannaschia、紅環(huán)菌屬Roseicyclus、檸檬胞菌屬Citreicella、暗棕色桿菌屬Phaeobacter、玫瑰變色菌屬Roseovarius和亞硫酸鹽桿菌屬Sulfitobacter等17個(gè)屬的40余個(gè)種。Roseobacter類(lèi)群細(xì)菌因其多樣的生理特征，被稱(chēng)為“生態(tài)泛化者”［16－18］，它們?cè)诤Ｑ笱匕渡鷳B(tài)系統(tǒng)的碳和硫循環(huán)中發(fā)揮著重要作用。比如，菌株ZH17與無(wú)機(jī)異養(yǎng)菌RuegeriapomeroyiDSS－3T有最近的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，兩者16SrRNA基因序列相似性為97.2%。菌株DSS－3T可利用一氧化碳和硫化物等無(wú)機(jī)物作為能量來(lái)源，從而減少對(duì)有機(jī)碳的消耗［17］。菌株ZH15、ZH40和以ZH18為代表的4個(gè)菌株（ZH18、ZH36、ZH39和ZH50）與紫色非硫光合細(xì)菌（Purple Non－sulfur Bacteria，PNSB）RhodobacteraestuariiJA29T［19］、RhodobactervinaykumariiJA123T［20］和RoseicyclusmahoneyensisML6T［21］有最近的 系 統(tǒng)發(fā)育關(guān) 系，16SrRNA 基因序列相似性分別為97.1%、98.3%和98.9%。而PNSB是一類(lèi)好氧不產(chǎn)氧光合細(xì)菌（Aerobic Anoxygenic Phototrophic Bacteria，AAPB），因其代謝類(lèi)型多樣而具有重要的生態(tài)學(xué)意義和應(yīng)用價(jià)值。PNSB具有光合、固氮、固碳、硝化、反硝化、產(chǎn)氫、硫化物氧化、降解大分子有機(jī)物等多種生理特征，且其富含蛋白質(zhì)、氨基酸等多種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，因此PNSB可應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖、污水處理、能源開(kāi)發(fā)、生產(chǎn)多聚羥基烷酸（PHA）等方面［22］。

4 小結(jié)

通過(guò)對(duì)鎮(zhèn)海潮間帶沉積物可培養(yǎng)細(xì)菌多樣性的研究表明，浙江近海沉積物中蘊(yùn)藏著豐富的微生物資源，而且它們?cè)诮５脑氐厍蚧瘜W(xué)循環(huán)中發(fā)揮著重要作用。然而，限于培養(yǎng)條件等因素，本研究獲得的菌株還只是浙江近海微生物資源的很小一部分。未來(lái)可通過(guò)分子生態(tài)分析以及優(yōu)化培養(yǎng)條件的手段，獲得更全面的浙江近海微生物資源和多樣性信息。

（References）：

［1］Zhejiang Province Statistical Bureau.Current situation and problems of maritime economic development for Zhejiang province［J］.China National Conditions and Strength，2007，5：63－64.

浙江省統(tǒng)計(jì)局.浙江海洋經(jīng)濟(jì)發(fā)展現(xiàn)狀及問(wèn)題［J］.中國(guó)國(guó)情國(guó)力，2007，5：63－64.

［2］HUO Yi－ying，XU Xue－wei，WANG Chun－sheng，et al.Bacterial diversity of the sediment from Cangnan Large Fishing Bay［J］.Acta Ecologica Sinica，2008，28（10）：5 166－5 172.

霍穎異，許學(xué)偉，王春生，等.浙江蒼南近海沉積物細(xì)菌物種多樣性［J］.生態(tài)學(xué)報(bào)，2008，28（10）：5 166－5 172.

［3］DU Ai－fang.Bacterial analysis in the water samples from the seacoast of Zhejiang Province［J］.Jounal of Zhejiang University：Agric ＆ Life Sci，2003，29（5）：523－528.

杜愛(ài)芳.浙江近岸海域細(xì)菌學(xué)分析［J］.浙江大學(xué)學(xué)報(bào)：農(nóng)業(yè)與生命科學(xué)版，2003，29（5）：523－528.

［4］HUANG Bei，MIN Huai，TANG Jing－liang，et al.Study of the microorganism community in Zhejiang offshore［J］.Environmental Monitoring in China，2009，25（2）：44－47.

黃備，閔懷，唐靜亮，等.浙江沿海海洋微生物群落的研究［J］.中國(guó)環(huán)境監(jiān)測(cè)，2009，25（2）：44－47.

［5］CHUN J，LEE J H，JUNG Y，et al.EzTaxon：a web－based tool for the identification of prokaryotes based on 16Sribosomal RNA gene sequences［J］.International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology，2007，57（10）：2 259－2 261.

［6］TAMURA K，PETERSON D，PETERSON N，et al.MEGA5：molecular evolutionary genetics analysis using maximum likelihood，evolutionary sistance，and maximum parsimony methods［J］.Molecular Biology and Evolution，2011，28（10）：2 731－2 739.

［7］HUO Ying－Yi，XU Xue－wei，LI Xue，et al.Ruegeriamarinasp.nov.，isolated from marine sediment［J］.International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology，2011，61（2）：347－350.

［8］SUN Feng－qin，WANG Bao－jiang，LI Guang－yu，et al.Diversity of bacteria isolated from the South China Sea sediments［J］.Acta Microbiologica Sinica，2008，48（12）：1 578－1 587.

孫風(fēng)芹，汪保江，李光玉，等.南海南沙海域沉積物中可培養(yǎng)微生物及其多樣性分析［J］.微生物學(xué)報(bào)，2008，48（12）：1 578－1 587.

［9］GONTANG E A，F(xiàn)ENICAL W，JENSEN P R.Phylogenetic diversity of Gram－positive bacteria cultured from marine sediments［J］.Applied and Environmental Microbiology，2007，73（10）：3 272－3 282.

［10］SURESH K，PRABAGARAN S R，SENGUPTA S，et al.Bacillusindicussp.nov.，an arsenic－resistant bacterium isolated from an aquifer in West Bengal，India［J］.International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology，2004，54（4）：1 369－1 375.

［11］KANSO S，GREENE A C，PATEL B K C.Bacillussubterraneussp.nov.，an iron－and manganese－reducing bacterium from a deep subsurface Australian thermal aquifer［J］.International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology，2002，52（3）：869－874.

［12］GREEN－RUIZ C，RODRíGUEZ－TIRADO V，GóMEZ－GIL B.Cadmium and zinc removal from aqueous solutions byBacillus jeotgali：pH，salinity and temperature effects［J］.Bioresource Technology，2008，99（9）：3 864－3 870.

［13］RODRíGUEZ－TIRADO V，GREEN－RUIZ C，GóMEZ－GIL B.Cu and Pb biosorption onBacillusthioparansstrain U3in aqueous solution：Kinetic and equilibrium studies［J］.Chemical Engineering Journal，2012，181－182：352－359.

［14］DELONG E F.Microbial community genomics in the ocean［J］.Nature Reviews Microbiology，2005，3（6）：459－469.

［15］GONZáLEZ J M，MORAN M A.Numerical dominance of a group of marine bacteria in the alpha－subclass of the class Proteobacteria in coastal seawater［J］.Applied and Environmental Microbiology，1997，63（11）：4 237－4 242.

［16］MORAN M A，BELAS R，SCHELL M A，et al.Ecological genomics of marine Roseobacters［J］.Applied and Environmental Microbiology，2007，73（14）：4 559－4 569.

［17］MORAN M A，BUCHAN A，GONZáLEZ J M，et al.Genome sequence ofSilicibacterpomeroyireveals adaptations to the marine environment［J］.Nature，2004，432（7 019）：910－913.

［18］POLZ M F，HUNT D E，PREHEIM S P，et al.Patterns and mechanisms of genetic and phenotypic differentiation in marine microbes［J］.Philosophical Transactions of the Royal Society B：Biological Sciences，2006，361（1 475）：2 009－2 021.

［19］VENKATA RAMANA V，ANIL KUMAR P，SRINIVAS T N R，et al.Rhodobacteraestuariisp.nov.，aphototrophic alphaproteobacterium isolated from an estuarine environment［J］.International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology，2009，59（5）：1 133－1 136.

［20］SRINIVAS T N R，ANIL KUMAR P，SASIKALA C，et al.Rhodobactervinaykumariisp.nov.，a marine phototrophic alphaproteobacterium from tidal waters，and emended description of the genusRhodobacter［J］.International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology，2007，57（9）：1 984－1 987.

［21］RATHGEBER C，YURKOVA N，STACKEBRANDT E，et al.Roseicyclusmahoneyensisgen.nov.，sp.nov.，an aerobic phototrophic bacterium isolated from a meromictic lake［J］.International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology，2005，55（4）：1 597－1 603.

［22］IMHOFF J.The phototrophic Alpha－Proteobacteria［M］//DWORKIN M，F(xiàn)ALKOW S，ROSENBERG EUGENE，et al.The Prokaryotes.New York：Springer，2006：41－64.