油茶皂素對茶輪斑病和茶白星病的抑菌作用

崔宏春，周鐵鋒，余繼忠，敖 存，黃海濤，鄭旭霞

(浙江省杭州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院 茶葉研究所，浙江 杭州 310024)

茶樹病蟲害中，病害由于危害影響不直接，且表現(xiàn)不明顯，但發(fā)生時則會嚴重影響茶葉的產(chǎn)量和品質(zhì)，如茶炭疽病、茶輪斑病、茶白星病等茶園病害時有發(fā)生，而且由于缺乏相關(guān)的研究，目前防治茶樹病害的手段極為有限［1］。當(dāng)前茶園常用的化學(xué)殺菌劑不僅存在一定毒性、污染環(huán)境、易引起抗藥性等問題［2］，而且其僅能起到預(yù)防的作用，對已發(fā)生病害的茶園則束手無策。一些有機茶園等對化學(xué)農(nóng)藥要求較高的茶園則只能采用修剪、焚燒等破壞性的方式處理。油茶皂素，又稱茶皂素，是茶籽或油茶餅中提取的一種五環(huán)三萜化合物，是一種天然的植物性殺菌劑［3］。由于其源于自然，具有無毒或低毒，對人畜安全，在自然環(huán)境下易分解，且不易產(chǎn)生抗性，不僅可以更好的達到殺菌抗病防蟲效果，而且對環(huán)境更加安全，對茶葉的質(zhì)量安全也更有保障。

茶輪斑病是茶園中最為常見的一種葉部病害，各產(chǎn)茶區(qū)均有分布。在嫩葉、成葉、老葉均見發(fā)病，都屬高溫高濕型病害，分別在5-6月 (梅雨期)和8-10月，秋季發(fā)生尤重。病重年份，可引致茶樹大量落葉，致使樹勢衰弱，嚴重影響次年春茶萌發(fā)、產(chǎn)量下降［4］。茶白星病又稱白斑病，星點病，國內(nèi)各茶區(qū)均有發(fā)生，一般以高山茶園發(fā)生較重。主要為害嫩葉、嫩芽、嫩莖及葉柄，以嫩葉為主，重病茶園通常減產(chǎn)20%～30%或更多。病葉制成的干茶，味苦澀，綠茶湯色發(fā)紅，嚴重影響成茶品質(zhì)［5］。

本研究對油茶皂素在茶園常見病害茶輪斑病、茶白星病病原菌菌絲生長和孢子萌發(fā)等的抑制效果進行了研究，并進行了室內(nèi)盆栽實驗，明確了油茶皂素對在茶園中常見病害茶輪斑病、茶白星病病原菌的抑菌效果，為無公害茶園植物性農(nóng)藥開發(fā)進行了探索。

1 材料與方法

1.1 供試材料

90%茶皂素原粉購自浙江省東方茶葉科技有限公司，病葉采自西湖區(qū)龍塢渤蘭灣農(nóng)場。

1.2 試驗處理方法

1.2.1 供試植物病原菌分離及培養(yǎng)

在茶園病害發(fā)病高峰期時采集病葉，采用組織分離法［6］分離病原菌，用經(jīng)過3次火焰滅菌的鑷子將病葉移入培養(yǎng)皿中，將培養(yǎng)皿翻轉(zhuǎn)放在26～28℃恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)。3～4 d后，挑選典型而無雜菌接近的菌落，在其邊緣用移菌針挑取帶有菌絲尖端組織的培養(yǎng)基一小塊，移入新的PDA培養(yǎng)基中，用連續(xù)稀釋培養(yǎng)法對菌株進行純化，獲得純培養(yǎng)菌株。

1.2.2 油茶皂素對病原菌菌絲生長的抑制作用

采用菌絲生長速率法測定［7］油茶皂素對菌絲生長的抑制性。將油茶皂素用無菌水配制成一系列濃度 的 母 液 (0，10，30，50，80，100，120mg·mL-1)，分別取一定量的母液加入到已用微波爐溶化的50℃左右的定量的PDA中，并加入微量鏈霉素 (抑制細菌生長)，趁熱充分搖勻后倒入無菌培養(yǎng)皿中，制成含藥PDA平板，每個濃度重復(fù)3次;待平板冷卻表面風(fēng)干以后，用直徑0.5 cm打孔器提取已培養(yǎng)好的新鮮的菌餅，菌絲面朝下接種到平板中央，蓋上皿蓋，置于相應(yīng)的溫度下恒溫培養(yǎng)，用無菌水作對照，整個操作過程在無菌條件下進行。72 h后用十字交叉法測量菌落直徑，按公式計算抑制率。

菌絲生長抑制率/%=(對照菌落生長直徑-處理菌落生長直徑)/對照菌落生長直徑×100。

1.2.3 油茶皂素對病原菌孢子萌發(fā)的抑制作用

把茶輪斑病菌和茶白星病菌接種在PDA培養(yǎng)基上，恒溫培養(yǎng)1周后，用PDA培養(yǎng)液的稀釋液洗下孢子，四層紗布過濾后，配成一定濃度的孢子懸浮液 (顯微鏡下每視野100個孢子)，將不同濃度的藥液 (0，10，30，50，80，100mg·mL-1)與孢子懸浮液各取50μL混和滴加于干凈的單凹片上，置于保濕培養(yǎng)皿內(nèi)，并于相應(yīng)溫度下分別培養(yǎng)8 h和24 h后，鏡檢孢子萌發(fā)情況，計算孢子萌發(fā)抑制率［8］。

1.2.4 油茶皂素對溫室茶苗茶輪斑病和茶白星病藥效

參照農(nóng)藥田間藥效試驗準則GB/T 17980.1～17980.53—2000，用茶籽培育出的溫室茶苗進行溫室盆栽試驗，測定油茶皂素對茶輪斑病和茶白星病的抑菌活性。具體研究內(nèi)容如下:選用當(dāng)年成熟的茶籽，浸種24 h，用強氯精消毒8 h，殺滅種子上帶著的雜菌，保證茶苗長勢良好。25℃下催芽48 h，選取芽長一致的茶苗種于塑料盆中，用珍珠巖覆蓋，置于溫室中培養(yǎng)。2個月后，選用室內(nèi)盆栽長勢一致的茶苗 (1心4，5葉)，用配置好的茶輪斑病病原菌和茶白星病病原菌的孢子懸浮液，噴霧接種到茶苗上［9］，在 8℃，空氣相對濕度(RH) ＞95%的黑暗條件下培養(yǎng)24 h，然后將用無菌水配制好的100mg·L-1油茶皂素溶液對接種茶輪斑病菌的茶苗和接種茶白星病菌的茶苗進行噴霧，藥量以噴至葉片開始滴水時為準。將茶苗置于(28±2)℃，RH＞95%，光照周期12∶12 h(L∶D)的條件下培養(yǎng)，1周后當(dāng)對照明顯發(fā)病時，調(diào)查感染葉片并分級，計算防治效果。

病情指數(shù)分級標準［10-11］如下:0級為無病斑，1級病斑占葉面1/4以下，2級病斑占葉面1/4～2/4，3級病斑占葉面2/4～3/4，4級病斑占葉面3/4以上。

病情指數(shù)=∑ (各級病葉數(shù)×各級代表值)/(調(diào)查總?cè)~數(shù)×最高級代表值)×100。

防治效果/%=(CK– YP) ×100/CK(CK為對照施藥后病情指數(shù)，YP為施藥后病情指數(shù))。

2 結(jié)果與分析

2.1 對病原菌菌絲生長的抑制作用

研究結(jié)果表明，油茶皂素對茶輪斑病菌及茶白星病菌的菌絲生長均有較明顯的抑制作用，隨著油茶皂素溶液濃度的升高，對2種菌絲生長的抑制率也升高 (表 1，2)，EC50分別為 30.20和 17.38mg·mL-1，毒力回歸方程如表。油茶皂素對茶白星病菌菌絲生長的抑制好于茶輪斑病。

2.2 對病原菌孢子萌發(fā)的抑制作用

研究結(jié)果表明，前8 h內(nèi)油茶皂素對茶輪斑病和茶白星病孢子均有很強的抑制作用，當(dāng)對照孢子萌發(fā)達90%以上時，加藥的茶輪斑病菌孢子均未萌發(fā);而茶白星病菌孢子加藥濃度為10mg·mL-1的有少量萌發(fā)，濃度30mg·mL-1以上的均未萌發(fā)，為萌發(fā)的孢子顏色呈深褐色，顏色明顯深于對照。24 h后加藥濃度為10mg·mL-1時，個別已經(jīng)萌發(fā)的茶輪斑病菌孢子的菌絲生長較對照出現(xiàn)明顯差異，菌絲短而且粗，顏色較深，并且隨著給藥濃度的增高，孢子萌發(fā)率也相應(yīng)降低，萌發(fā)孢子的菌絲也相應(yīng)的減短;而加藥濃度為30mg·mL-1以上的茶白星病孢子生長較對照才出現(xiàn)明顯差異，隨著給藥濃度的增高，孢子萌發(fā)率和萌發(fā)孢子的菌絲也相應(yīng)呈遞減趨勢，并且給藥濃度增大到80mg·mL-1時，孢子萌發(fā)率和萌發(fā)孢子的菌絲的遞減趨勢終止。

2.3 對茶輪斑病和茶白星病的溫室盆栽藥效

研究結(jié)果表明，油茶皂素對茶輪斑病和茶白星病具有一定的防治效果，濃度100mg·mL-1的油茶皂素藥液對茶白星病的防治效果較好 (表2)，達88.06%。

表2 油茶皂素對茶輪斑病和茶白星病的防效

3 小結(jié)

本文通過菌絲生長速率法測定油茶皂素對茶輪斑病原菌、茶白星病原菌菌絲生長及對這2種病原菌孢子萌發(fā)的抑制作用，初步得出油茶皂素對2種常見病害的病原菌有較好的抑菌作用，對其病原菌絲生長的抑制EC50分別為30.20和17.38mg·mL-1;并且，隨著油茶皂素溶液濃度的增加，抑制率也升高。油茶皂素能較好地抑制2種病菌的孢子萌發(fā)，特別是對茶輪斑病菌的孢子萌發(fā)抑制效果較好，低劑量給藥即可短時間內(nèi)抑制其孢子萌發(fā)。室內(nèi)盆栽實驗結(jié)果表明油茶皂素對茶輪斑病和茶白星病具有一定的防治效果，100mg·mL-1的茶皂素藥液對茶白星病防效達88.06%，對茶輪斑病的防效達74.58%。通過以上研究，可以看出油茶皂素對2種茶園常見病害有一定的防治效果，油茶皂素可以作為茶園植物性殺菌劑用于防治茶輪斑病和茶白星病。

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