PCR指紋圖譜分析在念珠菌性陰道炎、龜頭炎流行病學研究中的應用

江愛萍 黃劍清 盧萬丁 徐明 吳建華

(1.福州市皮膚病防治院，福州350025;2.上海長海醫(yī)院皮膚科，上海200433)

念珠菌性陰道炎和龜頭炎是指由念珠菌感染引起的外陰部感染。念珠菌性陰道炎是育齡期婦女的常見疾病，80% ～90%的病原體為白念珠菌［1］，經系統(tǒng)正規(guī)的治療可痊愈。但由于多種原因，常復發(fā)難以根治，形成復發(fā)性念珠菌性陰道炎(RVVC)。復發(fā)性念珠菌性陰道炎指婦女單純性念珠菌陰道炎經治療后，臨床癥狀和體征消失，真菌學檢查陰性后再次出現(xiàn)癥狀，經真菌學檢查又呈陽性或1 a內反復發(fā)作4次或以上，其病原菌主要是白念珠菌，是婦科的常見?。?-2］。但是，目前臨床上缺乏一種對念珠菌性陰道炎及龜頭炎的發(fā)病及復發(fā)后的病原體進行鑒定的手段，因此建立一種快速、準確的實驗檢測方法就顯得尤為必要。微衛(wèi)星又稱簡單重復序列 (Simple Sequence Repeat，SSR)，或短串聯(lián)重復 (Short Tandom Repeats，STRs)，是20世紀80年代末期繼限制性內切酶片段長度多態(tài)性之后發(fā)展起來的一種新型分子標記技術。以1～10 bp短核苷酸序列 (一般稱作核心序列)為基本單位，呈10～20次串聯(lián)重復狀廣泛隨機地分布于生物體的整個基因組。本文對16例RVVC患者前后兩次感染及3對夫妻同時感染分離的共22例病原體進行微衛(wèi)星PCR擴增，并對PCR指紋圖譜進行了分析。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2009年12月～2010年11月來我院門診就診并確診為復發(fā)性念珠菌性陰道炎的患者以及夫妻雙方同時感染念珠菌的患者分離出的菌株。經登記、取材、培養(yǎng)、菌種鑒定、保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 菌種的分離和鑒定

將標本接種于沙氏培養(yǎng)基，37℃孵育48 h。挑取沙氏培養(yǎng)基平板上單菌落，劃線接種到真菌顯色培養(yǎng)基上，37℃孵育24 h。顯色結果作為初步鑒定依據(jù)(白念珠菌菌落呈淡綠色)。采用API 20C AUX系統(tǒng)將所有實驗標本鑒定到種，確定22株實驗菌株中，19株 (86%)為白念珠菌;3株 (14%)為光滑念珠菌。

1.3 基因組DNA提取

挑取真菌單菌落，接種至3 mL沙氏液體培養(yǎng)基中，35℃，150 r/min振蕩孵育18 h。菌液濃度調至1～2×107CFU/mL時，使用TIANGEN真菌/酵母細胞裂解液，TIANGEN酵母DNA抽提 (小量)試劑盒抽提基因組DNA。0.8℅瓊脂糖凝膠電泳，140 V恒壓，25 min。BIO-RAD全自動凝膠成像分析儀上紫外拍照，顯示2.5 kb左右的高亮條帶。

1.4 微衛(wèi)星PCR

引物:5'-GACA GACA GACA GACA-3'，由上海生工合成。25μL反應體系中含:10×PCR Buffer 2.5 μL，引物 (10 μmol/L)1 μL，MgCl2(25 mmol/L)2.5 μL，dNTP Mixture(各 10 mmol/L)0.5 μL，Taq DNA polymerase 1 μL，模板DNA:25～30 ng，補足ddH2O至25μL。擴增條件:95℃預變性5 min;94℃ 40 s，45℃ 1 min，72℃ 1 min 循環(huán) 35 次，72℃延伸10 min。擴增產物各取10μL加樣于1.5%瓊脂糖凝膠，在140 V恒壓下電泳20 min。BIO-RAD全自動凝膠成像分析儀上紫外拍照。

1.5 聚類分析

將拍攝成像的電泳圖像按條帶有無分別賦值1和0，轉換為數(shù)值矩陣，然后用Ntsys 2.10e分析軟件進行遺傳相似性分析。該分析系統(tǒng)逐一比較兩個泳道每一條帶的位置關系，計算這兩株菌電泳條帶的相似系數(shù) (similarity coefficient，Sab)。Sab值越大說明兩者的親緣關系越近，考慮到實驗誤差，一般Sab≥0.8則認為該兩株菌株具有基因同源性，可被認定為同一株菌。并用此值作為界限將具有基因同源性的菌株分為若干族 (cluster)［3］，并按照UPMGA法構建系統(tǒng)進化樹。

2 結 果

2.1 菌種的分離和鑒定結果

共分離鑒定出22株念珠菌。其中白念珠菌19株;光滑念珠菌3株(其中兩株為同一患者前后兩次感染分離所得，另一株為夫妻雙方同時感染，配偶一方感染分離所得，見表1)。

表1 實驗菌株編號及其來源Tab.1 Source of Candida strains

2.2 單引物PCR擴增產物電泳結果

22株念珠菌的DNA經單引物PCR擴增，所得PCR產物電泳帶型穩(wěn)定，多態(tài)性較高，獲得了較為穩(wěn)定的PCR指紋圖譜。擴增的條帶數(shù)5～9條之間，大小介于100～2 000 bp(見圖1)。

圖1 22株念珠菌的PCR產物電泳圖譜 (M.DNA長度標記，從小到大依次為 100 bp、250 bp、500 bp、750 bp、1 000 bp、2 000 bp)Fig.1 PCR fingerprinting of 22 strains(M.DNA marker)

2.3 各菌株間相似系數(shù)

22株不同菌株之間的PCR擴增條帶數(shù)量和擴增片段的大小存在差異，采用Ntsys 2.10e分析軟件，對同一患者前后2次分離的菌株及夫妻同時分離的菌株進行相似系數(shù)分析 (Sab)，數(shù)值介于0.5及1.0之間 (見表2)。其中A1-1與A1-2，A6-1與A6-2，A2-1 與 A2-2，A7-1 與 A7-2，B1-1 與 B1-2，B2-1與B2-2，B3-1與 B3-2的相似系數(shù)大于0.8，可認為是同一菌株的復發(fā)或傳染。

表2 同一患者前后2次分離菌株及夫妻患者分離菌株相似系數(shù)Tab.2 Similar coefficient for intergroup comparison of the same patient or couples

2.4 各菌株的聚類樹狀圖

依據(jù)22株不同菌株的PCR擴增條帶數(shù)量和擴增片段的大小，采用NTsys 2.10e分析軟件對22株菌株進行分析后形成的聚類樹狀圖 (見圖2)。其中A1-1與A1-2，A6-1與A6-2親緣關系最近，與相似系數(shù)的分析結果一致。

圖2 各菌株的聚類樹狀圖Fig.2 Dendrogram for all 22 isolates from patients

3 討 論

目前認為RVVC反復發(fā)作的主要原因有:前次治療未徹底殺滅陰道腔和陰道上皮細胞內的念珠菌，數(shù)周或數(shù)個月后上皮細胞成熟過程中殘存念珠菌隨脫屑細胞再次進入陰道腔并繁殖;性伴侶常攜帶念珠菌而無癥狀;腸道念珠菌感染引起肛周繁殖;機體免疫功能下降;其他一些高危因素，如糖尿病及長期服用激素類藥物等［4-6］。即RVVC可分為傳染、復發(fā)及再感染三個主要原因。由于傳染、復發(fā)及再感染所致的念珠菌性陰道炎和龜頭炎的臨床治療方法不同，因此對念珠菌性陰道炎及龜頭炎的發(fā)病原因進行甄別就顯得尤為重要。同時，對于念珠菌性陰道炎及龜頭炎的臨床診治有著非常重要的指導的意義。通常對于復發(fā)的病例需要調整治療方案，比如選擇敏感藥物、加大劑量或延長療程。而對于再感染或性伴間傳播的病例，則需要對患者加強衛(wèi)生宣教，注意個人衛(wèi)生比用藥更重要。

本文中，我們采用微衛(wèi)星序列進行了PCR擴增指紋圖譜法對臨床上的16例前后兩次感染的菌株及6例同時感染的夫妻分離出的菌株進行分析。其中，4例即兩位患者前后感染的菌株的指紋圖譜相似系數(shù)達到了1.0;一對夫妻同時感染的菌株分別為白念珠菌和光滑念珠菌，相似系數(shù)僅為0.5;另16例，兩兩間的相似系數(shù)在0.6～0.9之間。不同的引物所擴增出來的條帶對實驗結果也有一定的影響，根據(jù)張有江等［7］的研究結果表明，使用引物M13 擴增時，種間 Sab為0 ～0.75，種內 Sab為 0.85 ～1.0;使用引物 T3B 時，種間 Sab為0 ～0.67，種內 Sab為0.90～1.0。兩菌株間的相似系數(shù)越大則親緣性越強。由于藥物選擇作用等的影響，再次引起發(fā)病的病原體的遺傳性狀在一定程度上有所改變［8-9］，加上PCR實驗誤差，一般認為相似系數(shù)大于0.8的兩株菌為同一株菌。在預實驗中，我們采用了M13通用引物、(GCA)5、(GACA)4三個微衛(wèi)星序列作為引物進行PCR擴增，僅(GACA)4擴增出來的序列的多態(tài)性比較明顯，可能由于菌株基因組序列的突變所致。針對一個微衛(wèi)星序列引物擴增出來的序列，可由于菌株一些位點突變導致一定的誤差。那么，對多位點微衛(wèi)星序列進行分析，得到的指紋圖譜則可能更為可靠，但是還有待于進一步細致的研究。

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