miR-10b與乳腺癌侵襲及預(yù)后的相關(guān)性研究

宋傳貴 傅芳萌 吳雪英 韓忠華 王川

福建醫(yī)科大學(xué)附屬協(xié)和醫(yī)院乳腺外科，福建 福州 350001

miR-10b與乳腺癌侵襲及預(yù)后的相關(guān)性研究

宋傳貴 傅芳萌 吳雪英 韓忠華 王川

福建醫(yī)科大學(xué)附屬協(xié)和醫(yī)院乳腺外科，福建 福州 350001

背景與目的：miR-10b通過增加其下游轉(zhuǎn)移基因RHOC的表達(dá)，影響腫瘤的轉(zhuǎn)移和侵襲能力。本研究探討miR-10b在乳腺癌石蠟組織中的表達(dá)及其與乳腺癌侵襲轉(zhuǎn)移及預(yù)后的關(guān)系。方法：采用實(shí)時(shí)定量PCR(real-time qPCR)對60例乳腺癌患者原發(fā)腫瘤蠟塊提取的RNA進(jìn)行miR-10b表達(dá)水平的測定，Mann Whitney-U非參數(shù)檢驗(yàn)比較miR-10b表達(dá)水平和乳腺癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系，預(yù)后分析采用Kaplan-Meier生存分析和log-rank計(jì)算。結(jié)果：miR-10b表達(dá)水平與乳腺腫瘤的大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、組織學(xué)分級、激素受體狀態(tài)、腫瘤病理分期、組織類型及是否復(fù)發(fā)等無明顯關(guān)系(P＞0.05)。Kaplan-Meier生存分析表明，miR-10b表達(dá)水平并不影響乳腺癌患者的生存期(P=0.485)。結(jié)論：miR-10b表達(dá)在乳腺癌侵襲轉(zhuǎn)移中的作用有限，并不是影響預(yù)后的主要因素，尚不足以作為基于石蠟組織標(biāo)本的乳腺癌預(yù)測預(yù)后指標(biāo)。

乳腺腫瘤； miR-10b； 轉(zhuǎn)移； 預(yù)后； 石蠟包埋組織

Mi(cro)RNA是一類小片段非編碼RNA分子，通過對靶mRNA降解、翻譯抑制調(diào)控癌或抑癌基因的表達(dá)，參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。miRNA在腫瘤細(xì)胞中表達(dá)水平的異常是腫瘤發(fā)生、發(fā)展的重要影響因素［1］。miR-10b作為miRNA家族中的一員，在乳腺癌、肝癌、胰腺癌等腫瘤組織中均存在異常表達(dá)，并且與腫瘤的侵襲及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移有密切關(guān)系［2］。miRNA可以長期穩(wěn)定保存在4%的甲醛溶液固定石蠟包埋(formalinfixation and paraffin-embedding，F(xiàn)FPE)的組織切片中，并可被高效抽提定量［3］。目前石蠟標(biāo)本中miRNA表達(dá)水平的研究尚少，本研究選擇可手術(shù)乳腺癌為研究對象，探討miR-10b的表達(dá)與乳腺癌臨床病理參數(shù)及預(yù)后的關(guān)系，確認(rèn)其是否可以作為臨床侵襲性及預(yù)后的預(yù)測指標(biāo)。

1.2 方法

1 資料和法

1.1 臨床資料

1.1.1 研究對象

選擇福建醫(yī)科大學(xué)附屬協(xié)和醫(yī)院2002年3月—2005年12月具有完整隨訪資料的非轉(zhuǎn)移原發(fā)性乳腺癌患者60例，年齡31～92歲，中位年齡為(52.3±12.6)歲。全部經(jīng)組織病理證實(shí)，隨機(jī)抽取，排除新輔助化療及晚期轉(zhuǎn)移患者(表1)。患者接受規(guī)范化治療，手術(shù)方式為改良根治術(shù)，術(shù)后輔助化療采用FAC或AC-T方案，ER陽性患者予以內(nèi)分泌治療(他莫昔芬)，腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移≥4個(gè)或腫瘤直徑≥5 cm者予以胸壁+鎖骨上區(qū)放療。

1.1.2 主要試劑和儀器

石蠟組織總RNA提取試劑盒(Recover AllTMTotal Nucleic Acid Isolation Kit)購自美國 ABI 公司；RT反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR-GreenⅠ熒光試劑盒(miRCURY LNATMUniversal RT microRNA PCR)購自丹麥Exiqon公司；hsa-miR-10引物、內(nèi)參U6 snRNA由Exiqon公司合成。 酶標(biāo)儀(DU-600型分光度計(jì))為Beckman公司產(chǎn)品，Real-time PCR儀ABI7500為美國Ambion公司產(chǎn)品。

1.2.1 蠟塊組織中提取RNA

將石蠟包埋的組織切成≥10 μm的薄片，取≤80 μm的石蠟組織，常規(guī)脫蠟，蛋白酶消化，操作按照ABI公司蠟塊組織提取試劑盒說明書進(jìn)行，離心柱洗脫出總RNA。檢測RNA溶液D260/D280吸光值，計(jì)算RNA濃度和純度，D260/D280比值介于1.8~2.1方可用于cDNA合成。2%瓊脂糖變性凝膠電泳檢測RNA的完整性。RNA存于-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 cDNA合成

表 1 miR-10b表達(dá)水平與乳腺癌臨床病理指標(biāo)間的關(guān)系Tab. 1 Correlation of miR-10b level and clinico pathological parameters of breast cancer

所有模板RNA濃度調(diào)至40 ng/μL，5×Reaction buffer 4 μL+Enzyme mix 2 μL+Nuclease-free water 10 μL+Template total RNA 4 μL，共20 μL體系，反應(yīng)條件為：42 ℃ 60 min，95 ℃ 5 min。

1.2.3 Real-time qPCR(實(shí)時(shí)熒光定量PCR)

反應(yīng)在實(shí)時(shí)定量P C R儀上完成。以第一鏈c D N A為模板應(yīng)用特定加尾結(jié)構(gòu)的引物，m i R-1 0結(jié)構(gòu)為：5’-UACCCUGUAGAACCGAAUUUGUG-3’。PCR擴(kuò)增體系為：cDNA 8 μL，SYBR Green master mix 10 μL，PCR mix 2 μL共 20 μL；反應(yīng)條件：94 ℃ 預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，56 ℃延伸30 s，72 ℃退火45 s，共40個(gè)循環(huán)，72 ℃10 min 延伸；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s (建立溶解曲線)。

1.2.4 Ct值計(jì)算

記錄每個(gè)反應(yīng)管中的熒光信號(hào)到達(dá)所設(shè)定的閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)即Ct值，每例標(biāo)本均加2個(gè)復(fù)孔檢測，Ct值取平均數(shù)；采用定量PCR中的相對定量法，以U6 snRNA作為內(nèi)參照，以2-ΔCt表示腫瘤組織目的基因的表達(dá)相對于內(nèi)參照的變化倍數(shù)，其中ΔCt =(CtmiR-10b-CtU6)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS 17版軟件。Mann-Whitney U檢驗(yàn)比較miR-10b表達(dá)水平和乳腺癌臨床病理參數(shù)關(guān)系，預(yù)后分析采用Kaplan-Meier生存分析和log-rank計(jì)算，所有統(tǒng)計(jì)采用雙側(cè)概率檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 miR-10b表達(dá)與乳腺癌臨床病理因素的關(guān)系

所有蠟塊組織重新切片，ER、PR及Her-2狀態(tài)，脈管瘤栓，組織學(xué)分級等經(jīng)過病理專家審核確定；分期根據(jù)AJCC乳腺癌TNM分期。復(fù)發(fā)患者包括局部復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。經(jīng)Mann-Whitney U非參數(shù)檢驗(yàn)，在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、ER及PR陰性或Her-2高表達(dá)的高侵襲性乳腺癌中，并未發(fā)現(xiàn)miR-10b表達(dá)水平升高(P>0.05)；同時(shí)未發(fā)現(xiàn)其與腫瘤大小、組織學(xué)分級、腫瘤病理分期、組織類型及腫瘤復(fù)發(fā)之間存在明顯相關(guān)性(表1)。

2.2 miR-10b表達(dá)與乳腺癌預(yù)后的關(guān)系

以平均值2-ΔCt=21.46作為截?cái)嘀?，將miR-10b水平分為高表達(dá)組(2-ΔCt>21.46)及低表達(dá)組(2-ΔCt<21.46)，Kaplan-Meier生存分析表明，miR-10b表達(dá)水平高低并不影響乳腺癌預(yù)后，總生存率log-rank分析結(jié)果見圖1(χ2=0.488，P=0.485)；無復(fù)發(fā)生存率log-rank分析結(jié)果見圖2(χ2=0.108，P=0.743)。

3 討 論

Ma等［4］在體外乳腺癌細(xì)胞系的研究表明，miR-10b表達(dá)可以促進(jìn)細(xì)胞侵襲，阻斷miR-10b，侵襲性較強(qiáng)的乳腺癌細(xì)胞侵襲力明顯下降；miR-10b主要在轉(zhuǎn)移性乳腺癌細(xì)胞中表達(dá)升高，而并非原發(fā)腫瘤細(xì)胞。本研究經(jīng)Mann-Whitney U檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)， miR-10b表達(dá)并未在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、ER陰性或Her-2高表達(dá)的具有高侵襲可能的原發(fā)癌中升高，由于本研究所選擇的均為M0的患者，故結(jié)果與上述研究并不矛盾。臨床研究還發(fā)現(xiàn)，miR-10b在約50%的轉(zhuǎn)移性乳腺癌中呈過度表達(dá)，在正常的乳腺組織中表達(dá)下調(diào)；而與正常組織相比，原發(fā)腫瘤組織中miR-10b表達(dá)水平下調(diào)更為顯著［4-6］。本研究結(jié)果提示，miR-10b在乳腺癌非轉(zhuǎn)移階段時(shí)的促侵襲作用微弱，在多步驟、多因素參與的腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移過程中，其作為預(yù)測指標(biāo)的價(jià)值尚需謹(jǐn)慎評估。Heneghan等［7］報(bào)道，ER陰性乳腺癌的循環(huán)血清miR-10b水平比ER陽性乳腺癌的明顯上調(diào)。本研究并未發(fā)現(xiàn)石蠟組織中miR-10b表達(dá)水平與ER/PR表達(dá)、組織學(xué)分級、組織類型等腫瘤發(fā)生的指標(biāo)相關(guān)，表明miR-10b表達(dá)可能與腫瘤發(fā)生的早期階段無關(guān)，而主要作用于腫瘤進(jìn)展的晚期階段。

Ma等［4］在研究中發(fā)現(xiàn)，miR-10b通過調(diào)控抑癌基因HoxD10的翻譯，增加其下游轉(zhuǎn)移基因RHOC的表達(dá)，進(jìn)而影響腫瘤的轉(zhuǎn)移和侵襲能力，其能否影響患者生存尚不明確。本研究經(jīng)Kaplan-Meier生存分析表明，石蠟組織中miR-10b表達(dá)水平的高低并不影響乳腺癌預(yù)后，log-rank計(jì)算顯示差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。據(jù)此說明，相對于影響預(yù)后的眾多因素，miR-10b效應(yīng)并不顯著。

總之，miR-10b在非轉(zhuǎn)移的乳腺癌中的表達(dá)并不能區(qū)分腫瘤的侵襲性高低，也不是影響預(yù)后的主要因素?；谑灲M織中miR-10b表達(dá)作為乳腺癌預(yù)測預(yù)后指標(biāo)的潛在價(jià)值有限，具體作用還需進(jìn)一步研究。

［1］LI H, BIAN C, LIAO L, et al. miR-17-5p promotes human breast cancer cell migration and invasion through suppression of HBP1 ［J］. Breast Cancer Res Treat, 2011, 126(3): 565-575.

［2］TAVAZOIE S F, ALARCON C, OSKARSSON T, et al.Endogenous human microRNAs that suppress breast cancer metastasis ［J］. Nature, 2008, 451(7175): 147-152.

［3］LI J, SMYTH P, FLAVIN R, et al. Comparison of miRNA expression patterns using total RNA extracted from matched samples of formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) cells and snap frozen cells ［J］. BMC Biotechnol, 2007, 7: 36.

［4］MA L,TERUYA-FELDETEIN J, WEINBERG R A. Tumour invasion and metastasis initiated by microRNA-10b in breast cancer ［J］. Nature, 2007, 449(7163): 682-688.

［5］IORIO M V, FERRACIN M, LIU C G, et al. MicroRNA gene expression deregulation in human breast cancer ［J］. Cancer Res, 2005, 65(16): 7065-7070.

［6］NEGRINI M, CALIN G A. Breast cancer metastasis: a microRNA story ［J］. Breast Cancer Res, 2008, 10(2): 203.

［7］HENEGHAN H M, MILLER N, LOWERY A J, et al.Circulating microRNAs as novel minimally invasive biomarkers for breast cancer ［J］. Ann Surg, 2010, 251 (3):499-505.

Correlation of miR-10b with invasiveness and prognosis of breast cancer

SONG Chuan-gui, FU Fang-meng, WU Xue-ying, HAN Zhong-hua, WANG Chuan(Department of Breast Surgery, Union Hospital Affiliated to Fujian Medical University, Fuzhou Fujian 350001, China)

SONG Chuan-gui E-mail：risingeast@163.com

Background and purpose：The miR-10b has the potential to promote invasiveness and metastasis of tumor by improving the expression ofRHOCgene. The objective of this study was to investigate the potential use of miR-10b as a novel breast cancer biomarker.Methods：Extracting RNA from the formalin-f i xation and paraff i nembedding (FFPE) breast cancer tissue, and the levels of miR-10b were quantified in specimens of 60 patients with operative breast cancer, by real-time quantitative polymerase chain reaction (RT-qPCR) analysis. The statistical analysis includedMann Whitney-U test, Kaplan-Meier curve and log-rank calculation.Results：There was no statistically significant correlation between miR-10b level and existing clinico pathological parameters of breast cancer, such as tumor size, nodal status, histological grade, hormone receptor status, tumor subtype, stage of disease or relapse result(P＞0.05). No correlation was found between miR-10b level and breast cancer survival (P=0.485).Conclusion：It is suggested that the role of miR-10b on invasiveness and prognosis of breast cancer is weak, which limits its potential use as disease classifier and prognostic factor on FFPE tissue.

Breast neoplasm; miR-10b; Metastasis; Prognosis;Formalin-f i xation and paraff i n-embedding

10.3969/j.issn.1007-3969.2012.01.007

R737.9

A

1007-3639(2012)01-0031-04

福建省教育廳基金(No: JA11120)；福建省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(No: 2006J0096)。

宋傳貴 E-mail:risingeast@163.com

2011-08-08

2011-11-24）