Importin 13在子宮內(nèi)膜異位癥和子宮內(nèi)膜癌中的表達(dá)及意義

龍行濤 王冬 田桂蘭 胡建國

1.重慶市腫瘤研究所，重慶市腫瘤醫(yī)院婦瘤科，重慶 400030；2.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院婦產(chǎn)科，重慶 400010

Importin 13在子宮內(nèi)膜異位癥和子宮內(nèi)膜癌中的表達(dá)及意義

龍行濤1王冬1田桂蘭1胡建國2

1.重慶市腫瘤研究所，重慶市腫瘤醫(yī)院婦瘤科，重慶 400030；2.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院婦產(chǎn)科，重慶 400010

背景與目的：正常情況下的子宮內(nèi)膜干/祖細(xì)胞有助于子宮內(nèi)膜的生理性修復(fù)，而子宮內(nèi)膜干/祖細(xì)胞的異常增殖和異常分化則會導(dǎo)致子宮內(nèi)膜疾病(如子宮內(nèi)膜異位癥和子宮內(nèi)膜癌)。Importin 13(IPO13)是importin β家族新成員的一個核質(zhì)雙向的轉(zhuǎn)運(yùn)受體蛋白，是角膜上皮干細(xì)胞的一個標(biāo)記，在維持干細(xì)胞的性狀、高增殖潛力、低分化狀態(tài)，調(diào)節(jié)細(xì)胞分化以及小鼠生殖細(xì)胞減數(shù)分裂上具有重要的作用。本文探討成體干細(xì)胞標(biāo)記IPO13在子宮內(nèi)膜異位癥和子宮內(nèi)膜癌中的表達(dá)及意義。方法：手術(shù)取正常子宮內(nèi)膜組織40例(對照組)，其中增生期和分泌期各20例，異位子宮內(nèi)膜組織20例(異位癥組)和子宮內(nèi)膜癌病灶組織20例(內(nèi)膜癌組)。采用免疫組化SP法檢測IPO13蛋白在細(xì)胞內(nèi)的定位；采用實時熒光定量PCR技術(shù)(real-time quantitative polymerase chain reaction，RT-PCR)檢測IPO13 mRNA的表達(dá)；Western blot檢測IPO13蛋白的表達(dá)。結(jié)果：IPO13蛋白在內(nèi)膜癌、異位癥及正常對照組中腺上皮細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中均有表達(dá)。IPO13蛋白在對照組增生期表達(dá)量(0.52±0.30)明顯高于分泌期(0.25±0.04，P＜0.05)；IPO13蛋白在異位癥組表達(dá)量(0.81±0.12)明顯高于對照組增生期及分泌期(P＜0.05)；IPO13蛋白在內(nèi)膜癌組表達(dá)量(1.21±0.11)明顯高于異位癥組(P＜0.05)。IPO13 mRNA在對照組增生期表達(dá)量是分泌期的3倍(P＜0.05)；IPO13 mRNA在異位癥組中表達(dá)量是對照組分泌期的6倍(P＜0.05)，增生期的2.5倍(P＜0.05)；IPO13 mRNA在內(nèi)膜癌組表達(dá)量是異位癥組的2倍(P＜0.05)。結(jié)論：IPO13在子宮內(nèi)膜癌中及異位癥組中表達(dá)明顯高于對照組，推測其高表達(dá)與子宮內(nèi)膜癌及子宮內(nèi)膜異位癥發(fā)病密切相關(guān)。

子宮內(nèi)膜異位癥； 子宮內(nèi)膜癌； Importin 13； 子宮內(nèi)膜干細(xì)胞

近年來研究認(rèn)為，正常情況下的子宮內(nèi)膜干/祖細(xì)胞有助于子宮內(nèi)膜的生理性修復(fù)，而子宮內(nèi)膜干/祖細(xì)胞的異常增殖和異常分化則會導(dǎo)致子宮內(nèi)膜疾病(如子宮內(nèi)膜異位癥和子宮內(nèi)膜癌)［1-2］。Importin 13(IPO13)是importin β家族新成員的一個核質(zhì)雙向的轉(zhuǎn)運(yùn)受體蛋白，是角膜上皮干細(xì)胞的一個標(biāo)記，在維持干細(xì)胞的性狀、高增殖潛力、低分化狀態(tài)，調(diào)節(jié)細(xì)胞分化以及小鼠生殖細(xì)胞減數(shù)分裂上具有重要的作用［3-5］。本研究擬采用免疫組化、熒光定量PCR技術(shù)(real-time quantitative polymerase chain reaction，RT-PCR)以及免疫印跡的方法檢測IPO13在子宮內(nèi)膜異位癥和子宮內(nèi)膜癌患者內(nèi)膜中的表達(dá)，探討其與子宮內(nèi)膜異位癥和子宮內(nèi)膜癌發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系及意義。

1 資料和方法

1.1 研究對象

隨機(jī)選取重慶市腫瘤醫(yī)院2010年7月—2011年4月開腹或者腹腔鏡手術(shù)治療的卵巢子宮內(nèi)膜異位囊腫、子宮內(nèi)膜癌和其他非激素依耐性良性內(nèi)膜疾病做宮腔鏡檢查的患者。征得重慶市腫瘤醫(yī)院倫理委員會通過并與患者達(dá)成協(xié)議，于手術(shù)時取異位子宮內(nèi)膜組織20例(異位癥組)和子宮內(nèi)膜癌病灶組織20例(內(nèi)膜癌組)。正常子宮內(nèi)膜采用美國史賽克公司5.07 mm連續(xù)灌流宮腔檢查及治療鏡，取正常子宮內(nèi)膜40例(增生期和分泌期各20例，對照組)，子宮內(nèi)膜組織各約0.5～1.0 g。以上各組患者在年齡等因素中具有可比性(P>0.05)。所有患者月經(jīng)周期均規(guī)律，術(shù)前3個月未接受激素治療，未妊娠及哺乳。經(jīng)組織病理學(xué)檢查證實，排除了合并子宮腺肌病、功血、多囊卵巢綜合征等其他激素依賴性疾病患者。

1.2 實驗方法

1.2.1 IPO13細(xì)胞內(nèi)定位

4%甲醛固定組織標(biāo)本，常規(guī)石蠟包埋，組織切片厚4 μm，HE染色后鏡下觀察到典型子宮內(nèi)膜組織者為入選標(biāo)本。山羊抗人IPO13(NB100-1369，稀釋度1∶100)多克隆抗體(Novus Biologicals)，免疫組化步驟按免疫組化SP試劑盒說明書操作，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色。陽性結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)：光鏡下每張切片選取5個有代表性高倍鏡視野，計數(shù)1 000個細(xì)胞，計算陽性細(xì)胞百分率。陰性為染色細(xì)胞數(shù)<5%，陽性為染色細(xì)胞數(shù)>5%。其中弱陽性為染色細(xì)胞數(shù)≤25%；強(qiáng)陽性為陽性染色細(xì)胞數(shù)>50%)［6］。

1.2.2 熒光定量RT-PCR檢測IPO13 mRNA的表達(dá)

用TRIzol(GIBCO公司)抽提組織總RNA，逆轉(zhuǎn)錄，PCR擴(kuò)增IPO13，并擴(kuò)增β-actin作為內(nèi)參物，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和RNA提取試劑購自寶生物工程(大連)有限公司。β-actin和IPO13引物以及熒光定量PCR試劑盒購于廣州復(fù)能基因有限公司(貨號分別為：Hs-QRP-20056、Hs-QRP-20468)。反應(yīng)條件：預(yù)變性 95 ℃10 min，95 ℃ 10 s，60 ℃ 20 s，72 ℃ 10 s，重復(fù)40個循環(huán)。陰性對照以無RNA酶的水代替cDNA模板，每例樣品及對照均設(shè)3個平行復(fù)孔，取平均值。反應(yīng)結(jié)束后，由軟件自動得出熒光反應(yīng)曲線以及每個標(biāo)本反應(yīng)體系的擴(kuò)增效率及CT值，實驗不同時間重復(fù)6次。

1.2.3 IPO13蛋白檢測

裂解組織以每孔25 μg上樣，行聚丙烯酰胺凝膠電泳，電轉(zhuǎn)移至PVDF膜，依次加入山羊抗人IPO13多克隆抗體(稀釋度1∶500)和辣根過氧化酶物標(biāo)記驢抗羊IgG，化學(xué)熒光發(fā)光法(ECL)顯影(碧云天公司)。操作過程按說明書進(jìn)行。用凝膠成像系統(tǒng)成像，對結(jié)果進(jìn)行灰度掃描分析，相對表達(dá)量以IPO13灰度面積積分分別與內(nèi)參的比值計算。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

統(tǒng)計分析運(yùn)用SPSS 11.5軟件，實驗數(shù)據(jù)為正態(tài)分布，所有數(shù)據(jù)方差具有齊同性，采用獨(dú)立樣本t檢驗進(jìn)行比較分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 免疫組化結(jié)果

IPO13蛋白在內(nèi)膜癌、異位癥及正常對照組中子宮內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中均有表達(dá)，主要表達(dá)于上皮細(xì)胞中(圖1)。

2.2 IPO13 mRNA在各組內(nèi)膜中表達(dá)

IPO13 mRNA在對照組增生期表達(dá)量是分泌期的3倍(P<0.05)；在異位癥組中表達(dá)量是對照組分泌期的6倍(P<0.05)，增生期的2.5倍(P<0.05)；在內(nèi)膜癌組表達(dá)量是對照組增生期的4倍(P<0.05)，分泌期的約10倍(P<0.05)，異位癥組的2倍(P<0.05，圖2)。

2.3 IPO13蛋白定量的檢測

IPO13蛋白在對照組增生期、分泌期、異位癥和內(nèi)膜癌組中的表達(dá)率均為100%，表達(dá)量分別為0.52±0.30、0.25±0.04、0.81±0.12和1.21±0.11。對照組增生期IPO13蛋白的表達(dá)量顯著高于分泌期(P<0.05)；異位癥組IPO13蛋白表達(dá)量均高于對照組分泌期及增生期(P<0.05)；內(nèi)膜癌組IPO13蛋白表達(dá)量均高于對照組分泌期及增生期也顯著高于異位癥組(P均<0.05，圖3)。

3 討 論

IPO13是目前所知的哺乳動物細(xì)胞中唯一具有雙向轉(zhuǎn)運(yùn)功能的受體蛋白［4］。另外研究還發(fā)現(xiàn)，IPO13的表達(dá)受到糖皮質(zhì)激素和機(jī)體發(fā)育期的雙重調(diào)控，IPO13能夠轉(zhuǎn)運(yùn)pax-6、pax-3、ubc9、MGN、RBM8、ElF1A、糖皮質(zhì)激素受體和肌足蛋白，并且IPO13和這些蛋白相互作用，精確地調(diào)控胚胎腦、肺和心臟的發(fā)育［3，5，7-10］。在角膜上皮干細(xì)胞中，IPO13對保持角膜緣干細(xì)胞的性狀、高增殖潛力、低分化狀態(tài)具有重要的作用。本研究顯示，在子宮內(nèi)膜癌及異位內(nèi)膜組織中IPO13 mRNA轉(zhuǎn)錄以及蛋白翻譯水平存在明顯上調(diào)。

子宮內(nèi)膜異位癥是一種良性疾病，但卻具有浸潤、廣泛種植和易復(fù)發(fā)等與惡性腫瘤相似的一些生物學(xué)特征［11］。因此，傳統(tǒng)的觀點(diǎn)認(rèn)為子宮內(nèi)膜異位癥是一種類癌疾病。近年來研究認(rèn)為，子宮內(nèi)膜疾病是子宮內(nèi)膜干/祖細(xì)胞增殖分化異常引起的［1，12］，異位內(nèi)膜組織中干細(xì)胞相關(guān)基因TCL1、UTF1和SALL4比正常內(nèi)膜表達(dá)增加［12］，調(diào)控干細(xì)胞增值分化的c-kit在異位內(nèi)膜中表達(dá)也上調(diào)［13］。子宮內(nèi)膜異位癥病灶雖為多中心起源，但每一局部病灶細(xì)胞呈明顯克隆性，而具有克隆能力是干細(xì)胞特征之一，提示子宮內(nèi)膜異位癥病灶可能是干細(xì)胞。IPO13在維持成體干細(xì)胞的“干性”、調(diào)控干細(xì)胞克隆形成和增殖分化中具有重要作用［4］。本研究發(fā)現(xiàn)，異位癥組IPO13表達(dá)較對照組增生期及分泌期內(nèi)膜顯著上調(diào)，這可能是異位內(nèi)膜中子宮內(nèi)膜干/祖細(xì)胞增殖分化異常引起的。因此，本研究推測IPO13/干細(xì)胞因子軸在子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)病中具有重要的意義，高表達(dá)IPO13蛋白可能與子宮內(nèi)膜異位癥的浸潤、復(fù)發(fā)相關(guān)。

Gargett等［14］通過對子宮內(nèi)膜上皮和基質(zhì)細(xì)胞克隆形成能力的鑒定證實子宮內(nèi)膜干細(xì)胞的存在。在子宮內(nèi)膜癌中，維持成體干細(xì)胞“干性”的Wnt/β-catenin和PTEN信號通路表達(dá)異常，端粒酶表達(dá)和活性增加也說明子宮內(nèi)膜癌是一種干細(xì)胞疾?。?2，15］。腫瘤細(xì)胞和干細(xì)胞一樣，具有自我更新和高增殖活性［16-17］。本研究發(fā)現(xiàn)，在子宮內(nèi)膜癌中IPO13從轉(zhuǎn)錄水平到蛋白表達(dá)水平顯著上調(diào)，其表達(dá)顯著高于對照組及內(nèi)膜異位癥組。因此，IPO13可能與子宮內(nèi)膜癌的發(fā)病、惡性進(jìn)展密切相關(guān)。在子宮內(nèi)膜癌中，可能受IPO13異常調(diào)節(jié)作用而發(fā)生了核質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)異常，但具體調(diào)節(jié)機(jī)制目前仍然不清楚，需進(jìn)一步研究。但本研究為從調(diào)控子宮內(nèi)膜干/祖細(xì)胞的增殖和分化的視角研究內(nèi)膜癌發(fā)病機(jī)制奠定了相關(guān)理論基礎(chǔ)。

綜上所述，子宮內(nèi)膜異位癥和子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生是多基因多步驟綜合作用的結(jié)果。IPO13是調(diào)控干細(xì)胞增殖分化中的蛋白，在調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖分化中具有重要的作用。IPO13可能參與了內(nèi)膜異位癥和內(nèi)膜癌中子宮內(nèi)膜干/祖細(xì)胞的異常增殖和分化的調(diào)控，其異常高表達(dá)有促進(jìn)子宮內(nèi)膜/干祖細(xì)胞異常增殖和異常分化的作用。目前臨床上對于子宮內(nèi)膜異位癥的治療還停留在手術(shù)和調(diào)控體內(nèi)激素分泌上。因此，從調(diào)控子宮內(nèi)膜干/祖細(xì)胞的增殖和分化的視角去研究子宮內(nèi)膜異位癥和子宮內(nèi)膜癌的發(fā)病機(jī)制和治療，還有待于進(jìn)一步深入。

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The expression and significance of importin 13 in endometriosis and endometrial carcinoma

LONG Xing-tao, WANG Dong, TIAN Gui-Lan, HU Jian-guo(Department of Gynecologic Oncology,Chongqing Cancer Hospital, Chongqing Tumor Institute, Chongqing 400030, China)

WANG Dong E-mail：cqwindow120@163.com

Background and purpose：Human uterine stem/progenitor cells activity contributes to the physiological endometrial repair, but abnormal proliferation and abnormal differentiation of uterine stem/progenitor cells will lead to endometrial disease (such as endometriosis and endometrial carcinoma). Importin 13 (IPO13) is the new family member of importin β, a two-way transfer of nuclear receptor proteins and a marker of corneal epithelial stem cells. In the maintenance of stem cells, high proliferative potential and poorly differentiated state play important roles in regulating normal and abnormal of cell differentiation and mouse germ cells meiosis. The study investigated the expression ofIPO13gene, an adult stem cell marker, in endometriosis and endometrial carcinoma tissues for the purpose of finding the relationship between this gene and endometriosis and endometrial carcinoma.Methods：The expression of IPO13 in normal endometrial tissues, endometriosis tissues and endometrial carcinoma tissues was detected by the immunohistochemistry, real-time PCR and Western blot respectively.Results：In endometrial carcinoma, endometriosis and control groups, the expression of IPO13 protein was found in cytoplasm and nucleus of epithelial cells and stromal cells. The expression level of IPO13 protein in normal proliferative phase endometrium was 0.52±0.30, significantly higher than that in normal secretory phase (0.25±0.04,P＜0.05); IPO13 protein in the ectopic endometrium was 0.81±0.12, significantly higher than that in proliferative phase and secretory phase endometria(P＜0.05); IPO13 protein in the endometrial carcinoma was 1.21±0.11, significantly higher than that in the ectopic endometrium (P＜0.05). The expression level of IPO13 mRNA in normal proliferative phase endometrium was 3 times higher than that in normal secretory phase (P＜0.05); IPO13 mRNA in the ectopic endometrium was 2.5 times higher than that in normal proliferative phase endometrium and 6 times higher than that in normal secretory phase endometrium(P＜0.05); IPO13 mRNA in the endometrial carcinoma were 2 times higher than that in the ectopic endometrium (P＜0.05).Conclusion：The expression of IPO13 in endometrial carcinoma and endometriosis is increased, which suggests IPO13 is closely related with endometrial cancer and endometriosis.

Endometriosis; Endometrial carcinoma; Importin 13; Endometrial stem cells

10.3969/j.issn.1007-3969.2012.01.003

R737.33

A

1007-3639(2012)01-0010-05

重慶市衛(wèi)生局課題資助(NO：08-2-284)。

王冬 E-mail:cqwindow120@163.com

2011-07-20

2011-11-07）