烤煙煙葉穩(wěn)定同位素與化學(xué)成分關(guān)系研究

郭東鋒，祖朝龍，李 田，姚忠達(dá)，舒俊生

（1.安徽中煙工業(yè)有限責(zé)任公司技術(shù)中心，合肥 230088；2.安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所，合肥 230061；3.安徽省煙草公司池州市分公司，安徽 池州 247100）

穩(wěn)定同位素技術(shù)是從地球化學(xué)研究發(fā)展而來的，從20世紀(jì)50年代開始就被用于生命科學(xué)的研究[1]。穩(wěn)定性同位素是天然存在于生物體內(nèi)的不具有放射性的一類同位素。碳元素和氮元素分別有兩種中子數(shù)不同的穩(wěn)定性同位素，即13C和12C以及14N和15N，其中重同位素（如13C和15N）在生物體內(nèi)的含量非常低[2]。近年來，以穩(wěn)定同位素作為示蹤劑研究生態(tài)系統(tǒng)中生物要素的循環(huán)及其與環(huán)境的關(guān)系、利用穩(wěn)定同位素技術(shù)的時(shí)空整合能力研究不同時(shí)間和空間尺度生態(tài)過程與機(jī)制，以及利用穩(wěn)定同位素技術(shù)的指示功能揭示生態(tài)系統(tǒng)功能的變化規(guī)律，已成為了解生態(tài)系統(tǒng)功能動(dòng)態(tài)變化的重要研究手段之一[3]。例如：在植物生理生態(tài)學(xué)方面，穩(wěn)定同位素技術(shù)使我們能從新的角度探討植物光合途徑、植物對(duì)生源元素吸收、水分來源、水分平衡和利用效率等問題[4-9]。在煙草的相關(guān)研究中，也有利用穩(wěn)定同位素作為研究手段，研究煙草對(duì)氮肥的吸收、利用[10-16]；但是在穩(wěn)定同位素與煙葉內(nèi)在化學(xué)成分之間的研究相對(duì)較少，本研究通過探索煙葉中穩(wěn)定同位素含量與煙葉內(nèi)常規(guī)化學(xué)成分之間的關(guān)系，為進(jìn)一步研究煙葉內(nèi)在化學(xué)成分與生態(tài)環(huán)境間的關(guān)系，探索煙葉質(zhì)量風(fēng)格形成與環(huán)境間的相互關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料

材料來源于云南、貴州、四川、福建、湖南、安徽等地的X2F、C3F、B2F三個(gè)等級(jí)煙葉樣品，共計(jì)51份，70 ℃烘干，粉碎過100目篩備檢。

1.2 方法

1.2.1 穩(wěn)定同位素檢測方法 氮同位素比值測定儀器與原理：1）δ15N樣品在元素分析儀中高溫燃燒后生成N2，質(zhì)譜儀通過檢測N2的與14N比率，并與國際標(biāo)準(zhǔn)物（大氣 N2）比對(duì)后計(jì)算出樣品的δ15N 比率值。測定精度：δ15N：±＜0.2‰；2）δ13C樣品在元素分析儀中高溫燃燒后生成CO2，質(zhì)譜儀通過檢測CO2的13C與12C比率，并與國際標(biāo)準(zhǔn)物（Pee Dee Belnite或 PDB）比對(duì)后計(jì)算出樣品的δ13C 比率值，δ13C：± ＜0.1 ‰。

主機(jī)型號(hào)：MAT253同位素比率質(zhì)譜儀（Isotope Ratio Mass Spectrometer），外部設(shè)備：Flash EA1112 HT 元素分析儀（Elemental Analyzer ）。

1.2.2 常規(guī)化學(xué)成分檢測方法 樣品在 MPA型近紅外光譜儀（Bruker，德國）測定煙葉中常規(guī)化學(xué)成分。

1.2.3 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析方法 采用 SPSS17.0和 DPS[17]軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，按參考文獻(xiàn)[18-19]進(jìn)行兩組變量間典型相關(guān)分析。

2 結(jié) 果

2.1 檢測結(jié)果統(tǒng)計(jì)描述

表1結(jié)果表明，氮同位素存在廣泛的變異，碳同位素和總碳含量變異范圍較??；煙葉化學(xué)成分中總氯含量存在廣泛變異。碳穩(wěn)定同位素、總氮、碳氮比、總糖、還原糖、總鉀峰度系數(shù)為負(fù)，數(shù)據(jù)分布為平闊峰，數(shù)據(jù)比較分散；其余指標(biāo)峰度系數(shù)為正值，數(shù)據(jù)分布為尖頂峰，數(shù)據(jù)分布較為集中。碳氮比、總糖、偏度系數(shù)為負(fù)數(shù)，為左偏態(tài)峰，其余指標(biāo)偏度系數(shù)為正值，為右偏態(tài)峰。

2.2 簡單相關(guān)分析

通過對(duì)煙葉中穩(wěn)定同位素以及常規(guī)化學(xué)成分進(jìn)行相關(guān)分析（Pearson相關(guān)）表明（表 2），碳穩(wěn)定同位素與氮穩(wěn)定同位素存在顯著正相關(guān)，與總氮含量呈極顯著正相關(guān)，與碳氮比存在極顯著負(fù)相關(guān)；碳穩(wěn)定同位素與總鉀含量存在極顯著負(fù)相關(guān)，與鉀氯比存在顯著負(fù)相關(guān)。

總碳含量與總氮含量呈顯著正相關(guān)，與煙堿含量呈顯著正相關(guān)，與總糖含量呈極顯著負(fù)相關(guān)，與還原糖呈極顯著負(fù)相關(guān)，與兩糖差、糖堿比均呈顯著負(fù)相關(guān)。

2.3 典型相關(guān)分析

將碳穩(wěn)定同位素（X1）、總碳（X2）、氮穩(wěn)定同位素（X3）、總氮（X4）、碳氮比（X5）作為第一組變量，將煙堿（Y1）、總糖（Y2）、還原糖（Y3）、總氯（Y4）、總鉀（Y5）、兩糖差（Y6）、兩糖比（Y7）、糖堿比（Y8）、鉀氯比（Y9）、氮堿比（Y10）作為第二組變量，對(duì)兩組變量進(jìn)行典型相關(guān)分析（結(jié)果見表3、4）結(jié)果表明，只有2組變量相關(guān)關(guān)系達(dá)到了極顯著水平，并且兩個(gè)相關(guān)關(guān)系極顯著變量組所包含的信息占兩組變量間總相關(guān)信息的51.77%，因此只分析這兩組典型變量，其他相關(guān)關(guān)系不顯著的在此不做分析。

表2 煙葉中穩(wěn)定同位素與化學(xué)成分簡單相關(guān)分析Table2 Correlation between stable isotope and chemical components in tobacco leaves

典型變量Ⅰ構(gòu)成如下：

U1=0.3958X1+0.5301X2+0.0869X3+0.813X4-0.6878X5

V1=0.6854Y1-0.6649Y2-0.4579Y3-0.0948Y4-0.3442Y5-0.4775Y6-0.3431Y7-0.7893Y8-0.0755Y9-0.4727Y10

第 1對(duì)典型變量Ⅰ（U1，V1），由相關(guān)系數(shù)可以看出，它與煙葉中總氮含量和總碳含量存在較高的正相關(guān)，而與碳氮比存在較高的負(fù)相關(guān)，所以U1可以理解為主要描述了總碳、總氮含量以及碳氮比高低大小的主要變化，即隨著總碳、總氮含量的增加 U1存在明顯增加的變化趨勢，隨著碳氮比的增加 U1存在明顯降低的變化趨勢。這一線性組合說明總碳、總氮和碳氮比與糖堿比、煙堿、總糖、還原糖、兩糖差關(guān)系密切，隨著煙葉中總碳、總氮含量的增加，糖堿比降低，煙堿含量存在上升，總糖、還原糖、兩糖差降低的變化趨勢。

典型變量Ⅱ構(gòu)成如下：

U2=0.9122X1-0.0497X2-0.26X3-0.2665X4+0.1889X5

V2=-0.0019Y1-0.0275Y2-0.0544Y3-0.1418Y4+0.7958Y5+0.0615Y6-0.07Y7-0.0324Y8+0.4031Y9-0.1926Y10

第 2對(duì)典型變量Ⅱ（U2，V2），由相關(guān)系數(shù)可以看出，它與煙葉中碳穩(wěn)定同位素存在很高的正相關(guān)性，可以理解為 U2隨著碳穩(wěn)定同位素含量的上升存在增加的變化趨勢。由與Yi的相關(guān)系數(shù)可以看出，它與鉀含量、鉀氯比存在較高的正相關(guān)，可以理解為 V2隨著總鉀含量和鉀氯比的上升存在增加的變化趨勢。這樣的線性組合說明煙葉中碳穩(wěn)定同位素與鉀含量、鉀氯比關(guān)系密切，即隨著煙葉中碳穩(wěn)定同位素豐度的提高，煙葉中鉀含量和鉀氯比存在降低的變化趨勢。

表3 煙葉中穩(wěn)定同位素與化學(xué)成分典型相關(guān)分析顯著性檢驗(yàn)Table3 Canonical correlation significance test between stable isotope and chemical components in tobacco leaves

表4 煙葉中穩(wěn)定同位素與化學(xué)成分顯著典型變量Table4 Significant canonical correlation variables between stable isotope and chemical components in tobacco leaves

3 討 論

碳穩(wěn)定同位素與氮穩(wěn)定同位素間存在顯著正相關(guān)關(guān)系，與總氮含量呈極顯著正相關(guān)關(guān)系，與碳氮比和總鉀含量存在極顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系，與鉀氯比存在顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系。碳穩(wěn)定同位素豐度與煙葉內(nèi)多項(xiàng)化學(xué)指標(biāo)存在不同程度的相關(guān)性，碳元素作為植物光合固定的初生代謝物，是植物生長發(fā)育以及代謝的基礎(chǔ)，所以與煙葉內(nèi)多項(xiàng)初生代謝產(chǎn)物存在高度的相關(guān)性。這也與本研究設(shè)想基本一致。

通過典型相關(guān)分析，說明總碳、總氮和碳氮比與糖堿比、煙堿、總糖、還原糖、兩糖差關(guān)系密切，隨著煙葉中總碳、總氮含量的增加，糖堿比降低，煙堿含量存在上升，總糖、還原糖、兩糖差降低的變化趨勢。隨著煙葉中碳穩(wěn)定同位素豐度的提高，煙葉中鉀含量和鉀氯比存在下降的變化趨勢。碳穩(wěn)定同位素與鉀以及鉀氯比存在極顯著和顯著的相關(guān)關(guān)系，鉀作為植物生長發(fā)育過程中相當(dāng)重要的元素，在植物代謝過程中水分運(yùn)輸、物質(zhì)調(diào)運(yùn)、很多關(guān)鍵性酶的組成等起到重要作用，所以鉀能夠促進(jìn)光合產(chǎn)物的運(yùn)轉(zhuǎn)，增加作物體內(nèi)糖分儲(chǔ)備等作用，因此碳同位素豐度與鉀存在極顯著相關(guān)關(guān)系。

結(jié)果中碳穩(wěn)定同位素變異范圍較小，而氮穩(wěn)定同位素存在廣泛變異。煙株通過光合固定CO2，可能由于不同的生態(tài)區(qū)域大氣中CO2有一定差異，通過光合固定、呼吸分餾等代謝作用留在煙葉內(nèi)變異不同所致；而氮穩(wěn)定同位素影響因素較多，主要由煙株從土壤中獲得，也可由施肥肥料、灌溉、降雨等因素引入不同來源，所以氮穩(wěn)定同位素豐度在不同煙葉中存在廣泛變異，且與煙葉化學(xué)成分相關(guān)關(guān)系難以捕捉。

本研究僅探索了穩(wěn)定同位素與煙葉化學(xué)成分的相互關(guān)系，對(duì)于環(huán)境中碳、氮穩(wěn)定同位素的動(dòng)態(tài)代謝過程，在煙葉生長發(fā)育過程中所起到的作用以及對(duì)煙葉質(zhì)量形成產(chǎn)生的影響，尚待進(jìn)一步研究。

[1]王艷紅，江洪，余樹全，等.硫穩(wěn)定同位素技術(shù)在生態(tài)學(xué)研究中的應(yīng)用[J].植物生態(tài)學(xué)報(bào)，2010，34（2）：179-185.

[2]易現(xiàn)峰，張曉愛.穩(wěn)定同位素技術(shù)在生態(tài)學(xué)研究上的應(yīng)用[J].生態(tài)學(xué)雜志，2005，24（3）：306-314.

[3]林光輝.穩(wěn)定同位素生態(tài)學(xué)：先進(jìn)技術(shù)推動(dòng)的生態(tài)學(xué)新分支[J].植物生態(tài)學(xué)報(bào)，2010，34（2）：119-122.

[4]Ehleringer J R, Field C B, Lin Z F, et al.Leaf carbon isotope and mineral composition in subtropical plants along an irradiance cline[J].Oecologia, 1986, 70:520-526.

[5]Ehleringer J R.Evolutionary and ecological aspects of photosynthetic pathway variation [J].Ann.Rev.Ecol.Syst, 1993, 24: 411-439.

[6]Mashall J D, Zhong P.Carbon isotope discrimination and water use efficiency in native plants of the North-central Rockies[J].Ecology, 1994, 75: 1887-1895.

[7]Pinder J E, Kroh G C.Insect herbivore and photosynthetic pathway in old-field ecosystems[J].Ecology, 68:254-259.

[8]Whelan T, Sackett W M, Benedict C R.Enzymetic fractiona-tion of carbon isotope by Phosphoenol pyruvate carboxylation from C4 plants[J].Plant Physiol., 1973,198751: 1051-1054.

[9]William E M, Carmozina de Araujo M, Renato C, et al.Contributions of C3 and C4 plants to higher trophic levels in an Amazonian savanna [J].Oecologia, 1999,119: 91-96.

[10]錢曉剛，楊宏敏，王偉，等.煙草對(duì)不同來源氮素的吸收、利用、分配的研究[J].中國煙草，1990（4）：29-32.

[11]單德鑫，楊書海，李淑芹，等.15N示蹤研究烤煙對(duì)氮的吸收及分配[J].中國土壤與肥料，2007（2）：15-19.

[12]侯雪坤，程巖，陳魁卿.應(yīng)用同位素15N、32P示蹤對(duì)烤煙氮、磷營養(yǎng)規(guī)律的研究[J].黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)學(xué)報(bào)，2003（4）：21-24.

[13]宋少堂，竇逢科，孫清禎.應(yīng)用15N示蹤技術(shù)研究煙草對(duì)氮素肥料的吸收與分配[J].河南農(nóng)業(yè)科學(xué)，1993（3）：22-25.

[14]韓錦峰，郭培國，黃元炯，等.應(yīng)用15N示蹤法探討煙草對(duì)氮素利用的研究[J].河南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，1992（3）：34-37.

[15]陳萍，李天福，張曉海，等.利用15N示蹤技術(shù)探討煙株對(duì)氮素肥料的吸收與分配[J].云南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2003（1）：36-38.

[16]郭培國，陳建軍，鄭燕玲，等.應(yīng)用15N示蹤法研究烤煙的氮素營養(yǎng)[J].中國煙草學(xué)報(bào)，1998（2）：29-31.

[17]唐啟義，馮明光.實(shí)用統(tǒng)計(jì)分析及其 DPS數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)[M].北京：科學(xué)出版社，2002.

[18]許自成，陳偉，肖漢乾，等.烤煙硝酸鹽含量與土壤養(yǎng)分的關(guān)系[J].生態(tài)學(xué)報(bào)，2006，26（6）：1889-1895.

[19]葉協(xié)峰，劉國順，凌愛芬，等.烤煙巨豆三烯酮含量與土壤理化性狀的典型相關(guān)分析[J]].生態(tài)學(xué)報(bào)，2009，29（8）：4223-4230.