督脈電針對(duì)大鼠脊髓損傷后神經(jīng)功能恢復(fù)的影響①

李兵奎，曾彬，常巍，王達(dá)義，郭振鵬，楊棋，劉濤

督脈電針對(duì)大鼠脊髓損傷后神經(jīng)功能恢復(fù)的影響①

李兵奎1a，曾彬2，常巍1a，王達(dá)義1a，郭振鵬1a，楊棋1a，劉濤1b

目的探討督脈電針治療對(duì)大鼠脊髓損傷后神經(jīng)功能恢復(fù)的影響。方法利用多中心急性脊髓損傷打擊器建立大鼠T11脊髓損傷模型，建模成功后隨機(jī)分為對(duì)照組(A組)和督脈電針組(B組)。脊髓損傷后1周，B組接受督脈電針治療。兩組大鼠于脊髓損傷后1、2、4、8周行BBB后肢運(yùn)動(dòng)功能評(píng)分，脊髓損傷后2、4、8周行體感誘發(fā)電位(SEP)檢測(cè)，脊髓組織行HE染色與神經(jīng)絲蛋白(NF200)免疫組化染色。結(jié)果SCI后1周，兩組大鼠BBB后肢運(yùn)動(dòng)功能評(píng)分無(wú)顯著性差異(P＞0.05)；SCI后2、4、8周，B組BBB后肢運(yùn)動(dòng)功能評(píng)分較A組明顯升高(P＜0.01)，SEP潛伏期明顯縮短、波幅明顯增高(P＜0.01)。HE染色顯示損傷區(qū)瘢痕組織及空洞形成，B組脊髓空洞比A組??；脊髓組織NF200陽(yáng)性表達(dá)B組各時(shí)間點(diǎn)較A組明顯增強(qiáng)(P＜0.01)。結(jié)論督脈電針治療可有效促進(jìn)SCI大鼠神經(jīng)功能恢復(fù)。

脊髓損傷；電針；督脈；體感誘發(fā)電位

[本文著錄格式]李兵奎，曾彬，常巍，等.督脈電針對(duì)大鼠脊髓損傷后神經(jīng)功能恢復(fù)的影響[J].中國(guó)康復(fù)理論與實(shí)踐,2012, 18(7):619-622.

脊髓損傷(spinal cord injury,SCI)是人類(lèi)致殘率最高的疾患之一[1]。脊髓損傷后，脊髓內(nèi)大量神經(jīng)元壞死或凋亡，使神經(jīng)細(xì)胞分泌的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子減少，破壞了支持軸突再生的有利微環(huán)境[2]；暴露的髓鞘相關(guān)抑制分子及繼發(fā)的膠質(zhì)瘢痕、空洞阻礙了軸突的生長(zhǎng)和正確連接[3]。這些不可逆的病理生理過(guò)程使脊髓損傷修復(fù)成為世界難題。電針作為中醫(yī)傳統(tǒng)治療方法，已引起越來(lái)越多研究者的關(guān)注。本研究觀察督脈電針治療對(duì)脊髓損傷大鼠神經(jīng)功能恢復(fù)的影響，并探討其可能的作用機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康成年雌性SPF級(jí)SD大鼠40只，體質(zhì)量200～250 g：湖北醫(yī)藥學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)：SCXK(鄂)2011-0008。實(shí)驗(yàn)中對(duì)動(dòng)物的處置符合中華人民共和國(guó)科學(xué)技術(shù)部《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見(jiàn)》標(biāo)準(zhǔn)[4]。

1.1.2 主要儀器及試劑 脊髓損傷打擊器(MASCIS Impactor M odelⅠ)：美國(guó)紐約大學(xué)；低頻電子脈沖治療儀(G6805-3型)：上海華宜醫(yī)用儀器有限公司；生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)(BL-420S型)：成都泰盟科技有限公司；生物顯微鏡(OLYMPUS-BX40)：日本OLYMPUS公司；Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件：M edia Cybernetics公司；兔抗神經(jīng)絲蛋白(Neurofilament 200, NF200)多克隆抗體(bs-0708R)：北京博奧森生物技術(shù)有限公司；快捷型酶標(biāo)羊抗兔IgG抗體(KIT-5005)、DAB顯色試劑盒：福州邁新生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 脊髓損傷模型的制備 大鼠10%水合氯醛3m l/ kg腹腔注射麻醉，俯臥位固定于解剖板上，術(shù)區(qū)備皮消毒。取后背部長(zhǎng)約3 cm切口，逐層切開(kāi)，切除T11椎板及棘突，顯露T11脊髓，暴露3×4mm打擊區(qū)。將大鼠移入脊髓損傷打擊器載物臺(tái)，鉗夾固定打擊區(qū)上下端椎骨，使打擊桿自2.5 cm高度自由落下，撞擊脊髓，打擊勢(shì)能為25 g·cm。術(shù)后每日常規(guī)肌注青霉素+慶大霉素預(yù)防感染，共3 d，并予以人工排尿、排便2次/d，直至大鼠排尿反射恢復(fù)。

1.2.2 動(dòng)物分組及干預(yù)措施 36只大鼠造模成功。分為對(duì)照組(A組)和督脈電針組(B組)，每組18只。SCI后1周，B組進(jìn)行督脈電針治療：大鼠清醒狀態(tài)下固定，直徑0.3mm毫針捻針?lè)ǚ謩e于大椎穴、命門(mén)穴緩慢進(jìn)針，深度達(dá)硬膜外，分別與低頻電子脈沖治療儀輸出端電極連接，大椎穴接正極，命門(mén)穴接負(fù)極，疏密波，頻率：密波60 Hz、疏波2 Hz，刺激強(qiáng)度以大鼠后肢出現(xiàn)輕微顫動(dòng)為度，每次20m in，每天1次。

1.2.3 后肢運(yùn)動(dòng)功能評(píng)定 于SCI后1、2、4、8周分別由兩名熟悉評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)但非本組實(shí)驗(yàn)人員的獨(dú)立觀察者根據(jù)BBB評(píng)分法[5]對(duì)大鼠后肢運(yùn)動(dòng)功能進(jìn)行評(píng)分，左右側(cè)下肢評(píng)分不相同時(shí)取平均值，每只大鼠的功能得分取兩人評(píng)分均值。

1.2.4 體感誘發(fā)電位(somatosensory evoked potential, SEP)檢測(cè)[6]于SCI后2、4、8周，各組隨機(jī)選取6只大鼠，進(jìn)行SEP檢測(cè)：10%水合氯醛3m l/kg腹腔注射麻醉，俯臥位固定于解剖板上；取頭頂部正中長(zhǎng)約1 cm切口，逐層切開(kāi)，顯露顱骨骨縫，以顱骨矢狀縫右側(cè)2 cm、冠狀縫后側(cè)2 cm處為記錄電極定位點(diǎn)；自定位點(diǎn)鉆入金屬針狀記錄電極，深度以剛穿透顱骨為限；將記錄電極與信號(hào)輸入端相連，參考電極夾于左側(cè)頭皮切口處，接地電極夾于右側(cè)顳部皮下；于大鼠左側(cè)坐骨神經(jīng)走行處插入2根毫針作為刺激電極，兩針相距1 cm，將刺激電極與刺激輸出端相連；打開(kāi)生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)，進(jìn)入“實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目-中樞神經(jīng)實(shí)驗(yàn)-大腦皮層誘發(fā)電位”模塊，輸出單脈沖刺激，可見(jiàn)大鼠左側(cè)后肢規(guī)律性抖動(dòng)；記錄雙側(cè)大腦皮層SEP，每側(cè)均記錄100次波形后疊加平均，得到最終結(jié)果。

1.2.5 脊髓組織病理學(xué)檢查 SEP檢測(cè)完畢后，大鼠灌注處死，具體方法如下：大鼠麻醉成功后，仰臥位固定于解剖板上，打開(kāi)腹腔，顯露肝臟，自劍突向兩側(cè)依次剪開(kāi)膈肌，于胸骨兩側(cè)“V”字形剪斷肋骨，用血管鉗夾住劍突向上翻開(kāi)胸骨并固定，充分顯露雙肺及心臟；用麻醉穿刺針自心尖部刺入，達(dá)主動(dòng)脈內(nèi)，固定穿刺針，拔出內(nèi)芯，穿刺針尾端連接輸液器；剪開(kāi)右心耳，以生理鹽水300m l經(jīng)主動(dòng)脈灌注，沖出大鼠體內(nèi)血液，直至肝臟顏色由紫紅色變?yōu)榛野咨?，右心耳流出清亮液體；再以4%多聚甲醛PBS溶液250 m l繼續(xù)灌注，當(dāng)大鼠四肢僵硬，眼睛發(fā)白，肝臟變?yōu)橥梁稚?、觸之堅(jiān)韌時(shí)，停止灌注。拔出穿刺針，將大鼠置于俯臥位，取出損傷區(qū)域脊髓組織經(jīng)甲醛固定、沖洗、脫水、透明、浸蠟、包埋，制成4μm厚切片。常規(guī)HE染色，顯微鏡下觀察脊髓組織形態(tài)。NF200免疫組化染色(SP法)，顯微鏡下觀察脊髓組織NF200的陽(yáng)性表達(dá)情況；每個(gè)標(biāo)本隨機(jī)選取2張切片，400×光鏡下隨機(jī)選取3個(gè)視野，應(yīng)用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件測(cè)量NF200陽(yáng)性產(chǎn)物的積分光密度值(integral optical density,IOD)，每個(gè)標(biāo)本取2×3個(gè)視野的平均值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料用(±s)表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)。若方差不齊或數(shù)據(jù)資料不服從正態(tài)分布，則采用秩和檢驗(yàn)。顯著性水平α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 一般情況 大鼠于術(shù)后2～4 h清醒。精神萎靡，行動(dòng)遲緩，雙后肢拖行，無(wú)活動(dòng)跡象，大小便障礙，出現(xiàn)截癱表現(xiàn)。SCI后1周內(nèi)，10只大鼠出現(xiàn)血尿，經(jīng)抗感染治療后多數(shù)好轉(zhuǎn)，2只死亡。SCI后2周內(nèi)，大鼠進(jìn)食、進(jìn)水量減少，體重逐漸下降，2只大鼠因麻痹性腸梗阻死亡。2周后，大鼠基本恢復(fù)排尿反射，進(jìn)食、進(jìn)水量恢復(fù)正常，體重逐漸增加。

2.2 后肢運(yùn)動(dòng)功能評(píng)分 SCI后兩組大鼠后肢運(yùn)動(dòng)功能均即刻喪失，BBB評(píng)分均為0分。SCI后1周，兩組大鼠BBB評(píng)分無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。SCI后2、4、8周，與A組比較，B組BBB評(píng)分明顯升高(P＜0.01)。見(jiàn)表1。

表1 SCI后不同時(shí)間點(diǎn)兩組大鼠BBB后肢運(yùn)動(dòng)功能評(píng)分

2.3 SEP檢測(cè) SCI后2、4、8周，與A組比較，B組SEP潛伏期明顯縮短、波幅明顯增高(P＜0.01)。見(jiàn)表2、表3。

2.4 病理學(xué)檢查

2.4.1 大體觀察 兩組大鼠脊髓標(biāo)本均可見(jiàn)損傷處直徑明顯變細(xì)，局部顏色加深，呈淡黃色。兩組間無(wú)明顯差別。

2.4.2 HE染色 兩組HE染色均可見(jiàn)損傷區(qū)組織結(jié)構(gòu)紊亂，尼氏體消失，細(xì)胞腫脹、空泡變性，瘢痕組織及空洞形成。其中A組脊髓空洞較大，B組脊髓空洞較小(圖1)。

2.4.3 NF200免疫組化染色 兩組大鼠脊髓組織均有NF200陽(yáng)性表達(dá)，主要分布于損傷區(qū)周?chē)?，呈棕黃色細(xì)絲狀。與A組比較，B組各時(shí)間點(diǎn)NF200陽(yáng)性表達(dá)均明顯增強(qiáng)(P＜0.01)。見(jiàn)表4。

表2 SCI后不同時(shí)間點(diǎn)兩組大鼠SEP潛伏期(ms)

表3 SCI后不同時(shí)間點(diǎn)兩組大鼠SEP波幅(μV)

表4 SCI后不同時(shí)間點(diǎn)兩組大鼠NF200表達(dá)(IOD值)

圖1 SCI后8周兩組大鼠脊髓組織(HE染色，200×)

3 討論

動(dòng)物脊髓損傷后神經(jīng)功能評(píng)定方法主要有運(yùn)動(dòng)功能評(píng)價(jià)、神經(jīng)電生理評(píng)價(jià)、組織形態(tài)學(xué)評(píng)價(jià)，實(shí)際應(yīng)用時(shí)應(yīng)將三者結(jié)合。

BBB法是目前許多學(xué)者較為推崇的一種運(yùn)動(dòng)功能評(píng)價(jià)方法，由Basso等[5]于1995年提出，用于評(píng)估大鼠運(yùn)動(dòng)功能。

神經(jīng)電生理評(píng)價(jià)是一種比較客觀的評(píng)定方法，其中體感誘發(fā)電位是一項(xiàng)敏感的神經(jīng)電生理指標(biāo)。國(guó)內(nèi)外研究表明，SEP與脊髓損傷程度具有較好的相關(guān)性，其變化可以反映脊髓傳導(dǎo)功能受損的程度[7]。

NF是構(gòu)成神經(jīng)元胞體和軸突的細(xì)胞骨架蛋白，是神經(jīng)元的特異性標(biāo)志之一[8]。正常情況下，NF200僅存在于軸突內(nèi)，胞體中含量很少或沒(méi)有；脊髓損傷后，NF200積存于神經(jīng)元胞體內(nèi)，免疫組織化學(xué)染色可使胞漿著色[9]，呈現(xiàn)為陽(yáng)性表達(dá)。NF200陽(yáng)性表達(dá)越強(qiáng)提示再生的神經(jīng)纖維越多，在形態(tài)學(xué)上反映神經(jīng)生長(zhǎng)的情況[10]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，督脈電針治療能提高NF200陽(yáng)性表達(dá)，促進(jìn)SCI大鼠損傷區(qū)神經(jīng)再生。

綜合BBB評(píng)分、SEP檢測(cè)、HE染色和NF200免疫組化染色結(jié)果，督脈電針治療對(duì)SCI大鼠神經(jīng)功能的恢復(fù)有肯定的促進(jìn)作用。

中醫(yī)理論認(rèn)為，督脈為“陽(yáng)脈之海”，具有總督一身之陽(yáng)經(jīng)、調(diào)節(jié)陽(yáng)經(jīng)經(jīng)氣的作用。脊髓損傷所致截癱為督脈受損，氣滯血淤，經(jīng)脈不通，筋脈肌肉失去氣血濡養(yǎng)而導(dǎo)致痿廢不用。針刺督脈可通調(diào)督脈陽(yáng)氣，直達(dá)病所，使腎強(qiáng)髓滿(mǎn)而達(dá)治療目的。

督脈電針既能調(diào)節(jié)經(jīng)氣、疏通氣血，同時(shí)又是一種脈沖電場(chǎng)，具有針刺和電場(chǎng)的雙重作用。其促進(jìn)SCI修復(fù)的作用機(jī)制可能為：電針能改善局部血液循環(huán)，減輕脊髓水腫[11]；抑制氧自由基和脂質(zhì)過(guò)氧化損傷[12]；減少興奮性氨基酸毒性，減少神經(jīng)元內(nèi)的鈣離子超載毒性[13]；抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡基因表達(dá)[14]；促進(jìn)神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子合成[15-16]；減少神經(jīng)抑制因子的形成，改善神經(jīng)再生微環(huán)境等。

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Effects of Du M eridian Electroacupuncture on Neurological Function of Rats after Spinal Cord In jury

LI Bing-kui,ZENG Bin, CHANGWei,etal.DepartmentofSpinal Surgery,Taihe Hospital,HubeiUniversity ofMedicine,Shiyan 442000,Hubei,China

Ob jectiveTo investigate the effect of Dumeridian electroacupuncture on the neurological function of rats after spinal cord injury(SCI).M ethodsThe SCImodel of ratswas induced w ith MASCIS Impactor at the level of T11segmentand were equally divided into control group(group A)and Dumeridian electroacupuncture group(group B).Group B received electroacupuncture once a day 1 week after SCI.They were assessed w ith Basso-Beattie-Bresnahan(BBB)score 1,2,4,8 weeks after SCI,somatosensory evoked potential(SEP)and spinal cord histopathological exam ination 2,4,8 weeks after SCI.Resu ltsThe difference of BBB score was not significant between the groups 1 week after SCI(P＞0.05),but improvedmore in group B than in group A 2,4,8 weeks after SCI(P＜0.01),aswell as the latency and wave amplitude of SEP(P＜0.01).There were scar tissue and syringomyelia in injured spinal cord,and the size of syringomyeliawas larger in group A than in group B.Neurofilament 200(NF200)expressed 2,4,8 weeks after SCI,and wasmore in group B than in group A(P＜0.01).ConclusionDumeridian electroacupuncture can promote the recovery of neurological function in ratsafter spinal cord injury.

spinal cord injury;electroacupuncture;Dumeridian;somatosensory evoked potential

R651.2

A

1006-9771(2012)07-0619-04

2012-04-27)

湖北省教育廳科學(xué)技術(shù)研究計(jì)劃重點(diǎn)項(xiàng)目(D20082403)。

1.湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬太和醫(yī)院，a.脊柱外科；b.病理科，湖北十堰市442000；2.湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬東風(fēng)公司總醫(yī)院內(nèi)科，湖北十堰市442000。作者簡(jiǎn)介：李兵奎(1979-)，男，湖北黃岡市人，碩士，主治醫(yī)師，主要研究方向：脊柱外科。通訊作者：常巍。

10.3969/j.issn.1006-9771.2012.07.007