人臍帶源神經(jīng)干細(xì)胞的培養(yǎng)和分化①

周劍云，孫煒，張新，王建軍，陳慧，張慶俊

人臍帶源神經(jīng)干細(xì)胞的培養(yǎng)和分化①

周劍云1,2，孫煒1,2，張新1,2，王建軍1,2，陳慧1,3，張慶俊4

目的研究誘導(dǎo)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(hucMSC)分化為神經(jīng)干細(xì)胞樣細(xì)胞(hucNSC)的方法。方法體外培養(yǎng)hucMSC，流式細(xì)胞儀鑒定細(xì)胞表型的表達(dá)。用堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、表皮生長(zhǎng)因子添加B27誘導(dǎo)，流式細(xì)胞學(xué)、免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定。用膠質(zhì)源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(GDNF)、白介素-1β(IL-1β)和全反式維甲酸(ATRA)等誘導(dǎo)分化，免疫組化染色、RT-PCR鑒定。結(jié)果hucMSC表達(dá)CD105、CD44、CD29。誘導(dǎo)后聚集成細(xì)胞球懸浮生長(zhǎng)，并不斷增殖，流式細(xì)胞儀鑒定失去hucMSC的表面標(biāo)志物特征，而表達(dá)Nestin、CD133。再經(jīng)RA、GDNF、IL-1β誘導(dǎo)，細(xì)胞表達(dá)膠質(zhì)纖維酸性蛋白、神經(jīng)元特異性烯醇化酶和酪氨酸羥化酶。結(jié)論hucMSC能分化為具有神經(jīng)干細(xì)胞樣生長(zhǎng)、增殖、分化特征的細(xì)胞。

人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞；神經(jīng)干細(xì)胞；多巴胺能神經(jīng)元；分化

[本文著錄格式]周劍云，孫煒，張新，等.人臍帶源神經(jīng)干細(xì)胞的培養(yǎng)和分化[J].中國(guó)康復(fù)理論與實(shí)踐,2012,18(7):615-618.

1 材料和方法

1.1 主要試劑 B27添加劑(B27 supplement)、RT-PCR試劑：INVITROGEN公司；重組人bFGF、重組人EGF、重組人白介素-1β(Interleukin-1β,IL-1β)、重組人膠質(zhì)源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(glial-derived neurotrophic fator,GDNF)：PEPROTECH公司；全反式維甲酸(all-trans retinoic acid,ATRA)、DAPI：SIGMA公司；CD44(PE)、CD29(APC)單克隆抗體：BD PHARM INGEN公司；CD105(FITC)單克隆抗體：ANCELL公司；小鼠抗人神經(jīng)元特異性烯醇化酶(neuron specific enolase,NSE)單克隆抗體：THERMO公司；兔抗膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)多克隆抗體、兔抗酪氨酸羥化酶多克隆抗體(tyrosine hydroxylase,TH)、兔抗巢蛋白(Nestin)多克隆抗體、兔抗CD133多克隆：北京博奧森生物技術(shù)技術(shù)有限公司。

1.2 hucMSC的培養(yǎng) 臍帶取自北京大學(xué)人民醫(yī)院足月新生兒剖宮產(chǎn)臍帶，均經(jīng)新生兒父母授權(quán)同意。方法見(jiàn)前期研究[4]。

1.3 向神經(jīng)干細(xì)胞樣細(xì)胞誘導(dǎo)(預(yù)誘導(dǎo)) 取第3、4代生長(zhǎng)狀態(tài)良好的hucMSC，0.25%胰蛋白酶消化，10%FBS中和后離心，配制預(yù)誘導(dǎo)液。用該培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，按1×105/m l接種于預(yù)先放置有多聚賴氨酸包被的消毒蓋玻片的24孔板中培養(yǎng)。

誘導(dǎo)方案分為3組：1組：DMEM/F12+bFGF+ EGF+B27；2組：DMEM/F12+bFGF+EGF；3組：DMEM/F12+bFGF+EGF+B27+1%FBS。藥物劑量：bFGF 20 ng/m l，EGF 20 ng/m l，B27為2%。在形成懸浮生長(zhǎng)的細(xì)胞球后終止誘導(dǎo)。倒置顯微鏡(日本Olympus)每8小時(shí)觀察細(xì)胞形態(tài)變化。

1.3.1 流式細(xì)胞儀檢測(cè) 分別取第3代hucMSCs和hucNSCs，去掉培養(yǎng)液，用PBS洗2遍，0.25%胰蛋白酶消化，PBS洗滌后制成濃度為3.0×106/m l單細(xì)胞懸液。分別加入抗人的CD44(PE)、CD29(APC)、CD105(FITC)單抗各5μl，4℃孵育30 m in，流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.3.2 免疫熒光染色 1組、2組部分在形成懸浮生長(zhǎng)的細(xì)胞球后終止誘導(dǎo)，免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)Nestin、CD133、NSE、GFAP、TH表達(dá)，并檢測(cè)第1、3、5天時(shí)Nestin、CD133表達(dá)變化。

吸取細(xì)胞懸液100μl，滴加在多聚賴氨酸處理過(guò)的防脫載玻片上，超凈臺(tái)內(nèi)風(fēng)干，4%多聚甲醛固定15m in，0.3%TritonX-100通透15m in，3%H2O2溶液封閉10m in，山羊血清室溫孵育10m in，加一抗4℃過(guò)夜；加Rhodam ine或fluorescein標(biāo)記的羊抗兔、羊抗小鼠IgG(1∶100)二抗工作液37℃孵育30 m in，DAPI復(fù)染。抗熒光衰減封片劑封片。相應(yīng)的熒光染料染色，免疫熒光顯微鏡下識(shí)別細(xì)胞。以不加入一抗處理的作為陰性對(duì)照染色。每步間經(jīng)0.01mol/L PBS (pH 7.2～7.4)浸洗3次，每次5m in。一抗分別為NSE(1∶1000)、CD133(1∶400)、Nestin(1∶400)、GFAP(1∶400)、TH(1∶400)。

1.4 向神經(jīng)細(xì)胞誘導(dǎo) 預(yù)誘導(dǎo)1組有懸浮生長(zhǎng)的細(xì)胞球形成后，繼續(xù)培養(yǎng)14 d，去掉誘導(dǎo)液，將細(xì)胞球接種于預(yù)先放置有多聚賴氨酸包被的消毒蓋玻片的24孔板中培養(yǎng)。根據(jù)在DMEM/F12培養(yǎng)液中加用誘導(dǎo)劑的不同分4組：1組：10%FBS；2組：ATRA；3組：GDNF+IL-1β；4組：ATRA+GDNF+IL-1β。2、3、4組培養(yǎng)液中添加1%FBS、1%B27。10 d后分別取部分有細(xì)胞生長(zhǎng)的玻片行免疫組織化學(xué)檢查。藥物劑量濃度為：GDNF 10 ng/m l，IL-1β10 ng/m l，ATRA 1.0 μmol/L。倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)變化

通過(guò)網(wǎng)絡(luò)分析儀調(diào)試的結(jié)果如圖8所示,其頻段為4.5 GHz～10 GHz。圖中通帶的邊頻點(diǎn)插損值分別達(dá)到了0.76 dB和0.57 dB,比圖4中協(xié)同仿真曲線上的A1、A2兩點(diǎn)值偏大,這是由低通濾波器、測(cè)試接頭及電纜線自身的損耗引起的;帶外兩邊的抑制分別達(dá)到了74 dB和35 dB,這與圖4中的協(xié)同仿真B1、B2值相比沒(méi)太大變化;而全腔仿真遠(yuǎn)端(6 GHz～10 GHz)的抑制均超過(guò)了34 dB,與圖4中協(xié)同仿真結(jié)果相比有極大的改善。

1.4.1 免疫熒光染色 誘導(dǎo)10 d后，各組細(xì)胞終止培養(yǎng)、誘導(dǎo)，取出玻片，加一抗4℃過(guò)夜，加Rhodam ine或fluorescein標(biāo)記的羊抗兔、羊抗小鼠IgG(1∶100)二抗工作液37℃孵育30m in，DAPI復(fù)染核。以不加入一抗的作為陰性對(duì)照染色。一抗分別為NSE(1∶200)、GFAP(1∶400)、TH(1∶400)。免疫熒光顯微鏡下觀察。每種抗體標(biāo)記的細(xì)胞至少計(jì)數(shù)10個(gè)低倍鏡視野(10×)，計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞百分率。

1.4.2 RT-PCR 各組分別取誘導(dǎo)分化后的細(xì)胞5×106，Trizol常規(guī)提取總RNA。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)為20μl體系，含1μg總RNA、12.5μg/m l隨機(jī)引物。NSE：94℃預(yù)變性5m in，94℃變性30 s，53℃退火30 s，72℃延伸30 s，30次循環(huán)后72℃延伸10m in；GFAP：94℃預(yù)變性5m in，94℃變性30 s，57℃退火45 s，72℃延伸45 s，30次循環(huán)后72℃延伸10m in；TH：95℃預(yù)變性5m in，94℃變性45 s，57.5℃退火45 s，72℃延伸2m in，35次循環(huán)后72℃延伸10m in。同時(shí)在相同條件下擴(kuò)增GAPDH。引物序列見(jiàn)表1。

表1 引物序列

2 結(jié)果

2.1 預(yù)誘導(dǎo)

2.1.1 形態(tài)學(xué) 預(yù)誘導(dǎo)1組加入預(yù)誘導(dǎo)液后24 h內(nèi)，細(xì)胞聚集成叢、成堆，由細(xì)長(zhǎng)梭形變?yōu)榘w為圓形或短梭形，折光性強(qiáng)，細(xì)胞團(tuán)可由數(shù)個(gè)至數(shù)百個(gè)不等細(xì)胞胞體聚集，周圍伸出不規(guī)則短突起。隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，胞體逐漸融合，鏡下細(xì)胞界限不清，突起逐漸縮短直至形成懸浮生長(zhǎng)的細(xì)胞球(圖1～圖3)。將細(xì)胞球機(jī)械吹打?yàn)閱渭?xì)胞懸液，單個(gè)細(xì)胞能繼續(xù)懸浮生長(zhǎng)，并逐漸擴(kuò)增形成小的細(xì)胞球，小的細(xì)胞球直徑逐漸增大形成大的細(xì)胞球。

圖1 hucM SC原代培養(yǎng)第7天(倒置相差顯微鏡，100×)

圖2 預(yù)誘導(dǎo)1組誘導(dǎo)24 h (倒置相差顯微鏡，100×)

圖3 懸浮細(xì)胞球形成(預(yù)誘導(dǎo)1組) (倒置相差顯微鏡，400×)

圖4 流式細(xì)胞學(xué)細(xì)胞表型鑒定

圖5 預(yù)誘導(dǎo)1組表達(dá)Nestin (免疫熒光，羅丹明標(biāo)記二抗，200×)

圖6 誘導(dǎo)1組(倒置相差顯微鏡，100×)

圖7 誘導(dǎo)1組(倒置相差顯微鏡，200×)

圖8 RT-PCR分析

預(yù)誘導(dǎo)2組細(xì)胞形態(tài)有類似變化，隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，無(wú)細(xì)胞聚集且無(wú)細(xì)胞球形成，細(xì)胞逐漸發(fā)生脫顆粒萎縮死亡。

預(yù)誘導(dǎo)3組細(xì)胞形態(tài)未發(fā)生變化，未見(jiàn)細(xì)胞聚集、成球；培養(yǎng)5～7 d后，可見(jiàn)少量由密集細(xì)胞集合成的細(xì)胞團(tuán)，罕見(jiàn)懸浮細(xì)胞球生成。

2.1.2 流式細(xì)胞學(xué)檢測(cè) hucMSCs的 CD29、CD44、CD105表面標(biāo)志為陽(yáng)性表達(dá)，同時(shí)表達(dá)CD29、CD44的細(xì)胞占5%，CD105陽(yáng)性率為35%；hucNSC CD29、CD44、CD105表達(dá)陰性(圖4)。

2.1.3 免疫熒光染色 預(yù)誘導(dǎo)1組細(xì)胞形成的懸浮細(xì)胞球Nestin(圖5)、CD133呈強(qiáng)表達(dá)，而不表達(dá)GFAP、NSE、TH等；預(yù)誘導(dǎo)2組1 d內(nèi)多數(shù)細(xì)胞Nestin弱表達(dá)，而CD133陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞占(49±1.7)%；第3天CD133和Nestin分別有(80±3.3)%、(91±3.1)%陽(yáng)性表達(dá)。

2.2 向神經(jīng)細(xì)胞誘導(dǎo)

2.2.1 形態(tài)學(xué)觀察 誘導(dǎo)1組細(xì)胞球逐漸分解，放射狀伸出細(xì)胞，細(xì)胞形態(tài)與hucMSC和神經(jīng)細(xì)胞的典型形態(tài)均不類似，少數(shù)細(xì)胞有較長(zhǎng)的突起。

誘導(dǎo)4組培養(yǎng)2～3 d后，可見(jiàn)細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形，有的伸出很長(zhǎng)的突起，胞核清晰；聚集的細(xì)胞逐漸分散生長(zhǎng)。10～17 d后，許多細(xì)胞體積逐漸縮小，變成卵圓形或圓形，無(wú)突起或向兩極伸出突起；有的細(xì)胞呈短梭形帶長(zhǎng)突起，或小圓胞體帶多突起；胞體折光性強(qiáng)；有的胞體不規(guī)則但突起較多，細(xì)胞突起可見(jiàn)連接成網(wǎng)(圖6、圖7)。

誘導(dǎo)2、3組形態(tài)無(wú)明顯變化。

2.2.2 免疫熒光染色 各組間GFAP、NSE、TH陽(yáng)性細(xì)胞百分率均有顯著性差異(P＜0.05)。見(jiàn)表1。

表1 各神經(jīng)細(xì)胞誘導(dǎo)組表面標(biāo)志表達(dá)

2.2.3 RT-PCR RT-PCR示NSE、GFAP、TH mRNA表達(dá)(圖8)。

3 討論

NSCs體外在存在生長(zhǎng)因子的無(wú)血清培養(yǎng)基中呈懸浮生長(zhǎng)，不斷增殖，形成由單一細(xì)胞組成的細(xì)胞球；撤去生長(zhǎng)因子，接種于涂有粘著劑的平皿中，則分化為神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞[1]。我們?cè)跓o(wú)血清培養(yǎng)基中加入EGF、bFGF、B27培養(yǎng)誘導(dǎo)hucMSC，細(xì)胞具有NSCs相似的懸浮、成球生長(zhǎng)、自我更新，表達(dá)Nestin、CD133等特征。

據(jù)報(bào)道，間充質(zhì)干細(xì)胞在向神經(jīng)細(xì)胞分化過(guò)程中，先轉(zhuǎn)變?yōu)楸磉_(dá)Nestin的細(xì)胞；進(jìn)一步誘導(dǎo)后，Nestin消失，但沒(méi)有形成NSCs樣細(xì)胞。我們推測(cè)這與培養(yǎng)基中殘留血清有關(guān)(預(yù)誘導(dǎo)3組)。我們也注意到，當(dāng)接種于孔板的細(xì)胞密度大時(shí)，細(xì)胞密集聚集，有的形成梭形球狀，但無(wú)懸浮生長(zhǎng)。無(wú)血清培養(yǎng)基中僅加入EGF、bFGF，可出現(xiàn)細(xì)胞聚集現(xiàn)象，但罕見(jiàn)形成細(xì)胞球，提示B27有較關(guān)鍵的作用，機(jī)理不清。

NSC在含10%血清培養(yǎng)基中會(huì)分化為各型神經(jīng)細(xì)胞。但hucNSC加含10%血清培養(yǎng)基后，沒(méi)有分化出形態(tài)上典型的神經(jīng)細(xì)胞，僅分化出少數(shù)表達(dá)GFAP的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞。經(jīng)聯(lián)合應(yīng)用RA、GDNF、IL-1β誘導(dǎo)，(57±4.3)%可分化為神經(jīng)元，其中多巴胺能神經(jīng)元占(9±3.1)%。提示hucNSC經(jīng)適當(dāng)誘導(dǎo)，可以獲得神經(jīng)細(xì)胞。

中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷及退行性病變的修復(fù)與再生一直是神經(jīng)科學(xué)研究的熱點(diǎn)。NSCs取材困難、不易獲得及倫理、法律方面的諸多問(wèn)題。很多人致力于將易獲取的干細(xì)胞于體外誘導(dǎo)分化為神經(jīng)細(xì)胞，以提供新的可移植神經(jīng)細(xì)胞來(lái)源。如骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞已成功地在體外誘導(dǎo)分化為神經(jīng)細(xì)胞[5-6]；我們前期也成功地誘導(dǎo)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞向神經(jīng)細(xì)胞分化[4]；有報(bào)道將臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)為多巴胺能神經(jīng)元[7]。但誘導(dǎo)得到的神經(jīng)細(xì)胞存在數(shù)量少、純化難、是否真正具備神經(jīng)細(xì)胞的生理功能、存活時(shí)間短等問(wèn)題[8]。未分化的NSCs可能更適合細(xì)胞移植。將間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源的NSCs用于細(xì)胞移植逐漸成為近年的研究熱點(diǎn)[2-3,9]。

臍帶為分娩廢棄物，來(lái)源廣泛，取材方便，無(wú)倫理及法律障礙。我們對(duì)臍帶源NSCs的生物特性做了初步探討，如何使臍帶源NSCs更接近于真正的NSCs，值得進(jìn)一步深入研究。

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Conversion of Hum an Um bilical Cord M esenchym al Stem Cells to Neural Stem Cell-like Cells in Vitro

ZHOU Jian-yun,SUNWei, ZHANG Xin,etal.Department ofNeurosurgery,CapitalMedical University School ofRehabilitation Medicine,Beijing Bo'aiHospital,China Rehabilitation Research Centre,Beijing 100068,China

Ob jectiveTo study the efficient conversion of human umbilical cord mesenchymal stem cells(hucMSC)into a neural stem cell-like population(hucNSC).M ethodsMSCs derived from umbilical cord were cultured and identified w ith fluorescence-activated cell sorting(FACS).They w ere induced w ith epidermal grow th factor(EGF),basic fibroblastgrow th factor(bFGF)and B27,and identified w ith FACS and immunocytochem istry.Then they w ere induced w ith glial-derived neurotrophic fator(GDNF),interleukin-1β(IL-1β)and all-trans retinoic acid(ATRA),and identified w ith immunocytochem istry and RT-PCR.Resu ltshucMSC expressed CD105,CD44and CD29.Induced w ith EGF,bFGF and B27,they expressed CD133and Nestin.Induced w ith GDNF,IL-1βand ATRA,they expressed glial fibrillary acidic protein,neuron specific enolase and tyrosine hydroxylase.ConclusionhucMSCmay be induced into hucNSC,namely the cellsw ith the characteristic grow th,proliferation and differentiation like NSCs.

human umbilical cordmesenchymalstem cells;neural stem cell;dopam inergic neurons;differentiation

R318.5

A

1006-9771(2012)07-0615-04

2011-11-02

2012-05-18)

1.首都醫(yī)科大學(xué)康復(fù)醫(yī)學(xué)院，北京市100068；2.中國(guó)康復(fù)研究中心北京博愛(ài)醫(yī)院神經(jīng)外科，北京市100068；3.中國(guó)康復(fù)研究中心醫(yī)學(xué)所，北京市100068；4.北京大學(xué)人民醫(yī)院神經(jīng)外科，北京市100044。作者簡(jiǎn)介：周劍云(1970-)，男，北京市人，博士，副主任醫(yī)師，主要研究方向：顱腦外傷、腦血管病、神經(jīng)康復(fù)醫(yī)學(xué)。通訊作者：張慶俊。

10.3969/j.issn.1006-9771.2012.07.006