肉堿對(duì)大鼠力竭運(yùn)動(dòng)后心肌線粒體呼吸鏈功能及抗氧化能力的影響＊

李 潔,余小燕

(1.西北師范大學(xué)體育學(xué)院,甘肅 蘭州 730070;2.青海省體育科學(xué)研究所,西寧 810000)

肉毒堿(Carnitine),簡(jiǎn)稱肉堿,又稱卡尼汀,有L型和D型,其中只有L-肉堿(L-Carnitine)具有生物活性,D型是其競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑。一般而言,肉堿均指L-肉堿。肉堿是線粒體膜上轉(zhuǎn)運(yùn)活化的長(zhǎng)鏈脂肪酸穿過(guò)線粒體內(nèi)膜,進(jìn)入β-氧化酶活躍的線粒體基質(zhì)的唯一載體,在能量代謝的調(diào)節(jié)中起著重要的作用。近年來(lái),肉堿的補(bǔ)充在運(yùn)動(dòng)實(shí)踐中的應(yīng)用價(jià)值引人注意,不斷有人從理論和實(shí)際使用中進(jìn)行探討[1]。已有研究表明,實(shí)驗(yàn)組運(yùn)動(dòng)員有氧能力的改善主要是由于組織內(nèi)脂肪供能的加強(qiáng)所致,而適當(dāng)補(bǔ)充肉堿可能正是改善脂肪代謝的關(guān)鍵。心肌細(xì)胞供能的主要方式是依賴發(fā)生于線粒體有氧條件下的脂肪酸β-氧化,而非糖氧化代謝,這一與其他組織絕然不同的供能方式?jīng)Q定了心肌細(xì)胞內(nèi)脂肪酸代謝的至關(guān)重要性[2]。肉堿具有提高心肌線粒體呼吸酶活性及保護(hù)線粒體膜結(jié)構(gòu)的作用,通過(guò)保護(hù)呼吸鏈的完整性,改善了心肌氧化磷酸化功能[3]。但目前研究尚未涉及運(yùn)動(dòng)過(guò)程中補(bǔ)充肉堿對(duì)心肌細(xì)胞生物氧化的影響。本研究擬采用補(bǔ)充肉堿和/或運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練的手段,通過(guò)測(cè)定大鼠心肌線粒體呼吸鏈酶及抗氧化酶活性,探討肉堿對(duì)大鼠心肌線粒體能量代謝的影響,以期為肉堿在運(yùn)動(dòng)實(shí)踐中的應(yīng)用提供指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)對(duì)象與分組

雄性健康2月齡Wistar大鼠50只[由蘭州大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,動(dòng)物生產(chǎn)許可證:SCXK(甘)2005-0007],體重130g左右。國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)嚙齒類動(dòng)物飼料喂養(yǎng),自由攝食飲水,室溫(23±2)℃,相對(duì)濕度50%±10%,自然采光,飼養(yǎng)室、用具等每周用紫外燈滅菌一次。

大鼠購(gòu)入后在動(dòng)物房飼養(yǎng)3 d,以適應(yīng)環(huán)境,然后進(jìn)行每天一次、共2 d的水平跑臺(tái)適應(yīng)性訓(xùn)練,每次運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度從10m/min開(kāi)始遞增到12 m/min,運(yùn)動(dòng)時(shí)間20min,使大鼠熟悉跑臺(tái)。根據(jù)體重和跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)適應(yīng)情況,淘汰體重過(guò)重或過(guò)輕及不適應(yīng)跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)的大鼠,保留40只大鼠進(jìn)行正式實(shí)驗(yàn)。將篩選出的40只大鼠隨機(jī)分為4組(n=10):對(duì)照組(C),補(bǔ)充肉堿組(LC),運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練組(T),運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練+補(bǔ)充肉堿組(T LC)。

1.2 肉堿補(bǔ)充方法

LC組和 T LC組大鼠每天按300mg/kg bw劑量[4]灌胃補(bǔ)充L-肉堿一次,其余大鼠灌胃同體積的蒸餾水。

1.3 訓(xùn)練安排

C組和LC組不進(jìn)行運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練。T組和T LC組采用遞增負(fù)荷水平跑臺(tái)運(yùn)動(dòng),第1周速度為 15 m/min,運(yùn)動(dòng)時(shí)間20min/d;第2周速度為20m/min,運(yùn)動(dòng)時(shí)間20min/d;第3～4周速度為25 m/min,運(yùn)動(dòng)時(shí)間40min/d;第5～6周速度為25 m/min,運(yùn)動(dòng)時(shí)間60min/d。每周訓(xùn)練6 d,共訓(xùn)練6周。

1.4 取樣及線粒體制備

第7周周一,各組大鼠分別進(jìn)行速度為30m/min的水平跑臺(tái)力竭運(yùn)動(dòng),并記錄力竭運(yùn)動(dòng)時(shí)間。力竭標(biāo)準(zhǔn)為:大鼠跟不上預(yù)訂跑臺(tái)速度,腹部與跑道面接觸,后肢蹬地?zé)o力,毛刷刺激驅(qū)趕無(wú)效,降低跑臺(tái)速度后,仍無(wú)力繼續(xù)運(yùn)動(dòng);行為特征為呼吸深急、幅度大,精神疲倦,俯臥位垂頭,表情冷漠、反應(yīng)遲鈍、基本無(wú)逃避反應(yīng)。力竭運(yùn)動(dòng)后即刻斷頭處死大鼠,于冰盤上迅速取出心臟,在冷生理鹽水中洗滌三次以上盡可能減少殘留血液,濾紙吸干稱重后置于液氮中冷凍,-20℃低溫保存待用。按文獻(xiàn)勻漿和提取心肌線粒體[5]。

1.5 測(cè)試指標(biāo)及方法

(1)線粒體呼吸鏈酶活性的測(cè)定:參照Vyatlina等[6]的方法。(2)蛋白濃度測(cè)定:牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn),考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定。(3)抗氧化酶活性的測(cè)定:超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活性、丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量的檢測(cè)方法嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明的操作程序進(jìn)行。

1.6 試劑與藥品

L-Carnitine、DB(2,3-dimethoxy-5-methyl-6-decyl-1,4-benzoquinone)、NADH(nicotinamide adenine dinuclectide-reduced)、rotenone、cytochrome 、antimycin 、BSA(bull serum albumin),CBB(coomassiebrilliantblue)均為sigma公司產(chǎn)品,DCPIP(2,6-dichlorophenolindophenol)為Fluka公司產(chǎn)品,超氧化物歧化酶(SOD)及丙二醛(MDA)測(cè)試盒為南京建成生物工程研究所提供,其余為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

1.7 主要儀器

UNIVERSAL 32R臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(德國(guó)),UV754N紫外分光光度計(jì)(上海精密科學(xué)儀器有限公司)。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 補(bǔ)充肉堿和運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練對(duì)大鼠力竭運(yùn)動(dòng)時(shí)間的影響

各組大鼠力竭運(yùn)動(dòng)時(shí)間(min)為:C組158.6±11.2,LC組172.3±23.4,T組201.9±15.7,T LC組226.8±36.5。與C組相比,LC組大鼠跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)至力竭時(shí)間延長(zhǎng)8.6%,但無(wú)顯著性變化,T組和T LC組顯著延長(zhǎng),分別延長(zhǎng)27.3%(P<0.05)和43%(P<0.01)。與LC組相比,T LC組顯著延長(zhǎng),延長(zhǎng)31.6%(P<0.05)。與 T組相比,T LC組延長(zhǎng)12.3%,但無(wú)顯著性變化。

2.2 大鼠心肌線粒體呼吸鏈CⅠ～Ⅳ活性的比較

CⅠ活性變化:與C組相比,LC、T和 T LC組均顯著升高(P<0.05,P<0.01),分別升高21.5%(P<0.05)、44.1%(P<0.01)和 88.2%(P<0.01);與LC組相比,T LC組顯著升高(P<0.01),升高54.9%;與T組相比,T LC組顯著升高(P<0.05),升高30.6%。CⅡ活性變化:與C組相比,LC組升高44.8%,但無(wú)顯著性變化,T和T LC組顯著升高,分別升高82.8%(P<0.05)和131.0%(P<0.01);與LC組相比,T LC組顯著升高(P<0.05),升高59.5%;與T組相比,T LC組升高26.4%,但無(wú)顯著性變化。CⅢ活性變化:與C組相比,LC組升高13.4%,但無(wú)顯著性變化,T和T LC組顯著升高,分別升高48.8%(P<0.05)和79.1%(P<0.01);與LC組相比,T LC組顯著升高(P<0.05),升高57.9%;與T組相比,T LC組升高20.3%,但無(wú)顯著性變化。CⅣ活性變化:與C組相比,LC、T和T LC組均顯著升高,分別升高62.9%(P<0.05)、88.3%(P<0.01)和 221.1%(P<0.01);與LC組相比,T LC組顯著升高(P<0.05),升高97.1%;與T組相比,T LC組顯著升高(P<0.05),升高 70.6%(表 1)。

Tab.1 Activity of respiratory chain complexes in mitochondria of rat myocardium after exhaustive running(μmol/(mg pro·min),,n=10)

Tab.1 Activity of respiratory chain complexes in mitochondria of rat myocardium after exhaustive running(μmol/(mg pro·min),,n=10)

CⅠ:Respiratory chain complexesⅠ;CⅡ:Respiratory chain complexesⅡ;CⅢ:Respiratory chain complexesⅢ;CⅣ:Respiratory chain complexesⅣ＊P<0.05,＊＊P<0.01vsC group;#P<0.05,##P<0.01vsLC group; △P<0.05vsT group

2.3 大鼠心肌線粒體SOD活性及MDA含量的比較

SOD活性變化:與C組相比,LC、T和 T LC組均顯著升高,分別升高29.8%(P<0.05)、43.0%(P<0.05)和63.9%(P<0.01);與LC組相比,T LC組顯著升高(P<0.05),升高26.3%;與 T組相比,T LC組顯著升高(P<0.05),升高14.6%。MDA含量變化:與C組相比,LC、T和T LC組均顯著降低,分別降低 18.8%(P<0.05)、14.6%(P<0.05)和 25.6%(P<0.01);與LC組相比,T LC組顯著降低(P<0.05),降低8.4%;與T組相比,T LC組顯著降低(P<0.05),降低 12.9%(表 2)。

Tab.2 Activity of SOD and the content of MDA in mitochondria of rat myocardium after exhaustive running(,n=10)

Tab.2 Activity of SOD and the content of MDA in mitochondria of rat myocardium after exhaustive running(,n=10)

SOD:Suproxide dismutase;MDA:Malondialdehyde＊P<0.05,＊＊P<0.01vsC group;#P<0.05vsLC group;△P<0.05vsT group

Group SOD activity(U/mg pro) MDA content(nmol/mg pro)C 16.21±2.39 11.04±0.73 LC 21.04±1.13＊ 8.96±0.42＊T 23.18±2.04＊ 9.43±0.37＊T LC 26.57 ±3.01＊＊#△ 8.21 ±0.25＊＊#△

3 討論

一般情況下,正常人能夠通過(guò)自身合成和消化道的吸收滿足自身需要的肉堿,但由于某些先天性疾病或代謝性疾病以及運(yùn)動(dòng)導(dǎo)致代謝加強(qiáng)可引起肉堿缺乏,從而影響正常的生理機(jī)能和運(yùn)動(dòng)能力的發(fā)揮[7]。已有研究表明,補(bǔ)充肉堿能夠顯著提高人體無(wú)氧閾下的做功能力、每搏耗氧量;顯著降低呼吸商、運(yùn)動(dòng)后的血乳酸值、二氧化碳生成等,從而延緩運(yùn)動(dòng)性疲勞,提高機(jī)體的有氧運(yùn)動(dòng)能力[8]。運(yùn)動(dòng)員服用肉堿,可提高機(jī)體血紅蛋白和血漿睪酮水平,長(zhǎng)期使用能改善心臟功能,加速脂肪氧化分解供能,提高機(jī)體的有氧運(yùn)動(dòng)能力等[9]。

3.1 補(bǔ)充肉堿及運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練對(duì)大鼠力竭運(yùn)動(dòng)時(shí)間的影響

大鼠跑臺(tái)至力竭的時(shí)間是反映運(yùn)動(dòng)能力的常用指標(biāo),運(yùn)動(dòng)能力的提高是機(jī)體抗疲勞能力加強(qiáng)最有力的宏觀體現(xiàn)。已有研究表明,補(bǔ)充肉堿可以明顯延長(zhǎng)大鼠游泳至力竭的時(shí)間[10]。本研究結(jié)果顯示,LC組、T組和 T LC組大鼠跑臺(tái)力竭時(shí)間均高于C組,其中T組和 T LC組具有顯著性變化,且 T LC組效果最佳。表明補(bǔ)充肉堿、運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練均可提高機(jī)體運(yùn)動(dòng)能力,且補(bǔ)充肉堿與運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練具有協(xié)同作用?？赡苁茄a(bǔ)充肉堿改善了在耐力性運(yùn)動(dòng)中脂肪供能能力和機(jī)體對(duì)運(yùn)動(dòng)刺激的適應(yīng)。

3.2 補(bǔ)充肉堿及運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練對(duì)大鼠力竭運(yùn)動(dòng)后即刻心肌線粒體呼吸鏈功能的影響

肉堿作為轉(zhuǎn)運(yùn)活化長(zhǎng)鏈脂肪酸進(jìn)入線粒體的載體,促進(jìn)脂肪酸的β-氧化,間接促進(jìn)檸檬酸循環(huán)。β-氧化和檸檬酸循環(huán)所形成的還原型輔酶,包括NADH和FADH2通過(guò)電子傳遞途徑被重新氧化。還原型輔酶上的氫原子以質(zhì)子形式脫下,其電子沿著呼吸鏈傳遞到分子氧。質(zhì)子和離子型氧結(jié)合而成水。在電子傳遞過(guò)程中釋放出大量自由能則使ADP磷酸化生成ATP。因此,呼吸鏈酶活性變化能夠間接反應(yīng)ATP的生成速率。

已有研究表明[3],肉堿具有提高線粒體呼吸酶活性及保護(hù)線粒體膜結(jié)構(gòu)的作用,通過(guò)保護(hù)呼吸鏈的完整性,改善了心肌氧化磷酸化功能。本研究結(jié)果顯示,與C組相比,LC組可提高大鼠心肌線粒體呼吸鏈CⅠ～Ⅳ活性,只是CⅡ和CⅢ活性無(wú)顯著性變化。表明補(bǔ)充肉堿可改善線粒體呼吸鏈酶活性尤其是起始端酶和末端氧化酶的活性,從而間接改善心肌氧化磷酸化功能。其機(jī)制可能是由于補(bǔ)充肉堿可緩解因長(zhǎng)時(shí)間的運(yùn)動(dòng)而造成必需肉堿的減少。β-氧化的速度很大程度上取決于可利用的肉堿量,高濃度的肉堿能增加脂肪的氧化速度[4]。在一次性力竭運(yùn)動(dòng)中肉堿將長(zhǎng)鏈脂肪從線粒體膜外運(yùn)送到膜內(nèi),促進(jìn)脂肪酸的β-氧化,增大了檸檬酸循環(huán)的流通量,使CⅠ的反應(yīng)底物NADH的量及供氧量增加所致。與C組相比,T組可使大鼠心肌線粒體呼吸鏈CⅠ～Ⅳ活性顯著升高。表明適宜的運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練可以使心肌線粒體呼吸鏈酶出現(xiàn)適應(yīng)性變化,使其活性得到提高。其機(jī)制可能是運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練調(diào)節(jié)了脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)步驟及脂肪酸氧化酶的活性,使參與檸檬酸循環(huán)及呼吸鏈酶的數(shù)量和活性增加,提高了脂肪能量的利用率。T LC組與C組和LC組相比,大鼠心肌線粒體呼吸鏈CⅠ～Ⅳ活性均顯著升高。與T組相比,CⅠ～Ⅳ活性升高,只是CⅡ和CⅢ活性無(wú)顯著性變化。表明運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練復(fù)合補(bǔ)充肉堿可有效的改善線粒體呼吸鏈酶復(fù)合體的活性,且補(bǔ)充肉堿與運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練具有協(xié)同作用。

3.3 補(bǔ)充肉堿及運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練對(duì)大鼠力竭運(yùn)動(dòng)后即刻心肌線粒體抗氧化能力的影響

長(zhǎng)期運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練之所以使機(jī)體受自由基損傷的程度不大,其機(jī)制可能是(1)有氧訓(xùn)練可使機(jī)體心肺功能增強(qiáng),組織氧利用率提高,從而減少因有氧氧化系統(tǒng)過(guò)度負(fù)荷和組織器官相對(duì)缺血缺氧所致的自由基生成。(2)由于抗氧化酶是在氧化應(yīng)激增強(qiáng)的情況下誘導(dǎo)產(chǎn)生的,長(zhǎng)期有氧訓(xùn)練使機(jī)體的氧化應(yīng)激程度提高,激發(fā)機(jī)體的抗應(yīng)激能力,也即抗氧化酶活性升高使體內(nèi)的自由基防御系統(tǒng)保持一個(gè)較高的水平。

補(bǔ)充肉堿提高機(jī)體抗氧化能力的機(jī)制可能是:(1)肉堿對(duì)抗脂質(zhì)過(guò)氧化物酶例如超氧化物歧化酶、過(guò)氧化氫酶和谷胱甘肽過(guò)氧化物酶起到抗氧化劑的作用;(2)通過(guò)穩(wěn)定生物膜,將膜重組為對(duì)自由基抗性大的膜起到抗氧化作用。長(zhǎng)鏈脂酰CoA具有表面活性劑作用,對(duì)以脂質(zhì)為主要組成成分的生物膜起破壞作用。肉堿與長(zhǎng)鏈脂酰CoA反應(yīng)生成長(zhǎng)鏈脂酰肉堿,促使長(zhǎng)鏈脂酰CoA的氧化利用,從而達(dá)到穩(wěn)定生物膜的作用;(3)可幫助脂溶性抗氧化劑越過(guò)線粒體。機(jī)體內(nèi)95%的自由基在線粒體內(nèi)產(chǎn)生,而大多數(shù)抗氧化劑例如維生素E是脂溶性的,它們需要在肉堿的幫助下,越過(guò)線粒體膜的載體才能起到在線粒體內(nèi)防止氧化和抗自由基損傷的作用;(4)可以激活脂肪酸代謝的關(guān)鍵酶,促進(jìn)脂肪酸代謝,維持ATP的水平和細(xì)胞穩(wěn)定的生理環(huán)境;(5)通過(guò)防止鐵螯合物的形成捕捉自由基,當(dāng)初級(jí)抗氧化防御屏障不能保證完全消除自由基時(shí),肉堿作為長(zhǎng)鏈脂肪?；妮d體,參與膜修復(fù)過(guò)程中膜磷脂的去?；?重酰化,有利于膜的及時(shí)修復(fù),起到次級(jí)抗氧化防御屏障的作用;(6)可以激活線粒體內(nèi)DNA修復(fù)酶,從而促進(jìn)DNA氧化損傷的修復(fù)。

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