大白菜根腫病抗性基因的標(biāo)記和定位

王彤彤 張淑江 章時(shí)蕃 李 菲 張 慧 孫日飛

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所，北京 100081）

大白菜根腫病是由蕓薹根腫菌（Plasmodiophora brassicae Woron.）侵染引起的世界性土傳病害，目前在很多國(guó)家都發(fā)生已久且普遍嚴(yán)重（楊永林，1990）。病原菌專(zhuān)性寄生于蕓薹屬等十字花科作物的根部，其休眠孢子可在土壤中存活長(zhǎng)達(dá)8 a甚至以上（Wallenhammar，1996），主要為害根部，侵染后導(dǎo)致根部細(xì)胞異常分裂和膨大，形成腫瘤，造成根的正常生理機(jī)能受阻，植株缺乏養(yǎng)分而生長(zhǎng)遲緩，枯萎落葉直至死亡。苗期和成株期均可以被感染，田間土壤一旦受到根腫病菌污染，將長(zhǎng)期帶菌，從而不再適合種植十字花科作物（孫保亞 等，2005）。近年來(lái)我國(guó)大白菜根腫病發(fā)病面積急劇增加，造成嚴(yán)重危害。培育抗根腫病品種是保證大白菜正常生產(chǎn)的重要措施，而利用分子標(biāo)記輔助選擇育種是經(jīng)濟(jì)有效的途徑之一。

InDel（Insertion-deletion Length Polymorphism）標(biāo)記是在等位基因位點(diǎn)上一定數(shù)量的核苷酸插入或缺失一段相對(duì)短的核苷酸序列而產(chǎn)生的長(zhǎng)度多態(tài)性變異（Jander et al.，2002），是基于全基因組測(cè)序的第三代分子標(biāo)記，具有標(biāo)記特異性高、穩(wěn)定性好、檢測(cè)方法簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)等優(yōu)點(diǎn)。這種新型標(biāo)記的使用可大大增加白菜類(lèi)作物中基于基因組序列的特異性分子標(biāo)記數(shù)量。本試驗(yàn)在實(shí)驗(yàn)室已有的大量InDel標(biāo)記的基礎(chǔ)上，構(gòu)建F2分離群體，利用分離群體分組分析法（Bulked Segregant Analysis，BSA）篩選與抗根腫病基因緊密連鎖的InDel標(biāo)記，從而為分子標(biāo)記輔助選擇育種奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試大白菜材料由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所白菜課題組提供。利用高抗根腫病的材料F1金錦2號(hào)（編號(hào)A00645）和奈斯高（編號(hào)A00647）自交，分別構(gòu)建包含197個(gè)和207個(gè)單株的F2群體，通過(guò)根腫菌接種鑒定進(jìn)行抗性遺傳分析，以大白菜品種黃美春作為感病對(duì)照。接種所用根腫病菌由本所菜病綜防課題組提供。

1.2 方法

1.2.1 根腫菌接種方法 人工接種采用普通菌土法（李妍 等，2011），接種量為 1 g滅菌土含0.05 g腫根，取適量帶有根腫菌的病根用組織打碎機(jī)打成勻漿，過(guò)濾，靜置2 h，使游動(dòng)孢子從孢子囊中充分釋放。而后按照一定比例加水和滅菌土充分混合，制成孢子含量為8×106個(gè)·g-1（干土）的菌土，播種土全部為菌土。

1.2.2 根腫病抗性鑒定 2010年12月12日，將A00645、A00647和感病對(duì)照黃美春各15粒種子，兩個(gè)F2群體各選197粒和207粒種子，經(jīng)催芽后播種于裝有菌土的苗缽中。土壤保持濕潤(rùn)，溫度不低于 17 ℃。于 2011年 3月 10日洗凈根部泥土，按 0～7級(jí)標(biāo)準(zhǔn)調(diào)查單株發(fā)病情況，0級(jí)：根系正常，無(wú)病害；1級(jí)：主根未發(fā)生病害，須根、側(cè)根有個(gè)別細(xì)小根瘤；3級(jí)：主根出現(xiàn)病害癥狀但腫大不明顯，須根、側(cè)根較多根瘤或根瘤直徑或長(zhǎng)度超過(guò)0.5 cm；5級(jí)：主根腫大明顯，腫大部分直徑為莖基的2～3倍，大部分須根、側(cè)根有腫瘤；7級(jí)：主根腫大明顯，腫大部分直徑為莖基的3倍以上。0、1級(jí)為抗病，3、5、7級(jí)為感病。接種鑒定試驗(yàn)在本所菜病綜防課題組溫室進(jìn)行。病情指數(shù)（DI）計(jì)算方法為：

病情指數(shù)=〔Σ（各級(jí)病株數(shù)×相應(yīng)級(jí)別值）/（調(diào)查總株數(shù)×發(fā)病最高級(jí)別代表值）〕×100

其中病情指數(shù)＜10為抗病，病情指數(shù)≥10為感病。

1.2.3 基因組DNA提取及建池 采集大白菜單株葉片，凍干磨成粉末。采用改良CTAB法對(duì)凍干樣品提取基因組DNA（Wang et al.，2005），用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA，并用Nanodrop ND1000（Gene Company Limited，China）檢測(cè)DNA濃度及純度。根據(jù)所測(cè)濃度，將單株 DNA濃度稀釋至50 ng·μL-1。利用BSA法（Michelmore et al., 1991），根據(jù)F2群體接種鑒定結(jié)果選取10株高抗單株構(gòu)建抗病池，10株高感單株構(gòu)建感病池。

1.2.4 InDel反應(yīng)體系建立和引物篩選 本試驗(yàn)中InDel標(biāo)記反應(yīng)體系的建立，主要對(duì)PCR反應(yīng)體系中幾個(gè)核心影響因素進(jìn)行優(yōu)化組合，從而確定出最佳的PCR反應(yīng)體系。均采用20 μL標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)體系：50 ng·μL-1基因組 DNA 5 μL，10×PCR buffer（含 Mg2+）2 μL，10 mmol·L-1dNTPs 1.6 μL，2.5 U·μL-1Taq DNA 聚合酶 0.2 μL，5 μmol·L-1正、反向引物各 0.4 μL，用 ddH2O調(diào)整體系終體積為20 μL。PCR擴(kuò)增程序?yàn)?4 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性40 s，57 ℃退火40 s，72 ℃延伸40 s，35個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸5 min，16 ℃保存。PCR產(chǎn)物加入5 μL非變性雙色緩沖液，利用8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)，電泳恒壓120 V，0.5×TBE為緩沖液。利用快速銀染法染色（Sanguinetti et al.，1994），照相保存。統(tǒng)計(jì)多態(tài)性條帶，并把存在多態(tài)性條帶的引物再次在抗性池中擴(kuò)增，驗(yàn)證多態(tài)性。

1.2.5 多態(tài)性標(biāo)記在群體中的驗(yàn)證及繪制遺傳連鎖圖譜 將在抗感病池中表現(xiàn)多態(tài)的標(biāo)記在 F2分離群體中進(jìn)行驗(yàn)證，檢測(cè)標(biāo)記在群體中的多態(tài)性。統(tǒng)計(jì)帶型，利用JoinMap4.0軟件分析目的基因和分子標(biāo)記位點(diǎn)的連鎖關(guān)系，選擇最小LOD閾值2.0構(gòu)建連鎖圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 大白菜根腫病抗性遺傳分析

F1（A00645）為高抗，自交后代 F2群體（A00645-4）197個(gè)單株經(jīng)過(guò)根腫菌接種鑒定，得到156個(gè)抗病單株和41個(gè)感病單株。經(jīng)卡方檢測(cè)，符合3∶1的孟德?tīng)栠z傳分離比例（χ2=1.63＜=3.84），說(shuō)明該材料中根腫病抗性為單基因顯性遺傳，該性狀可以按照質(zhì)量性狀進(jìn)行分析；F1A00647表現(xiàn)高抗，自交后代 F2群體（A00647-3）207個(gè)單株經(jīng)根腫菌接種鑒定，得到165個(gè)抗病單株和42個(gè)感病單株。經(jīng)卡方檢測(cè)，也符合3∶1的分離比（χ2=2.20＜=3.84），說(shuō)明該材料中根腫病抗性也是由顯性單基因控制。

2.2 InDel標(biāo)記篩選

利用A00645-4群體構(gòu)建抗感病池，篩選了720對(duì)InDel引物，其中12對(duì)引物擴(kuò)增出了多態(tài)性片段。進(jìn)一步將這12對(duì)引物進(jìn)行F2群體單株驗(yàn)證，結(jié)果得到9個(gè)與抗根腫病基因連鎖的InDel標(biāo)記，分別為 BrID10867，BrID11233，BrID11509，BrID11507，BrID10781，BrID11683，BrID90269，BrID11689，BrID10353（表 1）。

2.3 遺傳連鎖分析

在 197個(gè)單株的 F2群體 A00645-4中驗(yàn)證 9個(gè)標(biāo)記的多態(tài)性（圖 1）。統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)后，利用JoinMap 4.0軟件，LOD閾值5.0，分析數(shù)據(jù)并繪制遺傳連鎖圖。其中，BrID90269和BrID11683距離抗根腫病基因最近，分別為2.0 cM和2.5 cM，BrID10353距離抗病基因最遠(yuǎn)，為16.2 cM（圖 2）。

2.4 大白菜抗根腫病基因的定位

9個(gè)InDel連鎖標(biāo)記均位于大白菜連鎖群A8上。其中BrID90269、BrID 11683和 BrID11689均位于 A8連鎖群的Scaffold 10上，因此確定該根腫病抗性基因CR位于Scaffold10上（圖2）。根據(jù)大白菜基因組測(cè)序結(jié)果以及抗病基因保守結(jié)構(gòu)域在白菜基因組上的基因注釋?zhuān)瑯?biāo)記BrID90269和BrID11683之間的區(qū)域內(nèi)預(yù)測(cè)有6個(gè)抗病基因，并且這些抗病基因成簇分布。

表1 與抗根腫病基因連鎖的InDel標(biāo)記信息

圖1 InDel標(biāo)記在抗感病池和單株中的擴(kuò)增圖譜

圖2 遺傳連鎖圖

3 討論

本試驗(yàn)通過(guò) InDel標(biāo)記 BrID90269和BrID11683將抗根腫病基因 CR定位在大白菜連鎖群A8上，具體是在Scaffold10上一個(gè)大于1450 kb的區(qū)間內(nèi)。目前報(bào)道的抗根腫病基因中，CRa（Matsumoto et al.，1998；Hayashida et al.，2008），CRb（Piao et al.，2004），Crr3（Hirai et al.，2004），CRk（Sakanoto et al.，2008）皆位于A3上，Crr2和Crr4（Suwabe et al.，2006）分別位于A1和A6上，CRc（Sakanoto et al.，2008）位于 A2 上，只有 Crr1（Suwabe et al.，2003）位于A8上。但是與Crr1緊密連鎖的SSR標(biāo)記BRMS-088在本試驗(yàn)所用材料擴(kuò)增后沒(méi)有多態(tài)性。將BRMS-088標(biāo)記引物序列與白菜基因組比對(duì)后發(fā)現(xiàn)，該標(biāo)記位于 A8的Scaffold 97上，兩個(gè)基因不在染色體的同一區(qū)域，因此初步認(rèn)為本試驗(yàn)定位的抗病基因 CR和Crr1可能不是同一位點(diǎn)。根據(jù)大白菜測(cè)序結(jié)果以及抗病基因保守結(jié)構(gòu)域在白菜基因組上的基因注釋?zhuān)谒ㄎ坏腟caffold10的區(qū)間內(nèi)預(yù)測(cè)有6個(gè)抗病基因，且成簇分布。本試驗(yàn)結(jié)果有助于抗根腫病基因的精細(xì)定位以及進(jìn)一步的克隆，并且所得到的緊密連鎖InDel標(biāo)記可用于分子標(biāo)記輔助選擇育種，加速培育大白菜抗根腫病優(yōu)良品種。

李妍，謝學(xué)文，向文勝，石延霞，李寶聚，王平.2011.白菜根腫病的接種方法.植物保護(hù)學(xué)報(bào)，38（1）：95-96.

孫保亞，沈向群，郭海風(fēng)，周永紅，盧維豐.2005.大白菜抗根腫病遺傳規(guī)律初探.中國(guó)蔬菜，（6）：15-17.

楊永林.1990.十字花科蔬菜根腫病抑菌型土壤初探.植物保護(hù)學(xué)報(bào)，17（2）：127-131.

Hayashida N，Takabatake Y，Nakazawa N，Aruga D，Nakanishi H，Taguchi G，Sakamoto K，Matsumoto E.2008.Construction of a practical SCAR marker linked to clubroot resistance in Chinese cabbage，with intensive analysis of HC352b genes.J Japan Soc Hort Sci，77（2）：150-154.

Hirai M，Harada T，Kubo N，Tsukada M，Suwabe K，Matsumoto S.2004.A novel locus for clubroot resistance in Brassica rapa and its linkage markers.Theor Appl Genet，108：639-643.

Jander G，Norris S R，Rounsley S D，Bush D F，Levin I M，Last R L.2002.Arabidopsis map-based cloning in the post-genome era.Plant Physiology，129：440-450.

Matsumoto E，Yasui C，Ohi M，Tsukada M.1998.Linkage analysis of RFLP markers for clubroot resistance and pigmentation in Chinese cabbage（Brassica rapa ssp.pekinensis）.Euphytica，104：79-86.

Michelmore R W，Paran I，Kesseli R.1991.Identification of markers linked to disease-resistance genes by bulked segregant analysis：a rapidmethod to detect markers in specific genomic regions by using segregating populations.Proceedings of the National Academy of Sciences，88：9828.

Piao Z Y，Deng Y Q，Choi S R，Park Y J，Lim Y P.2004.SCAR and CAPS mapping of CRb，a gene conferring resistance to Plasmodiophora brassicae in Chinese cabbage（Brassica rapa ssp.pekinensis）.Theor Appl Genet，108：1458-1465.

Sakamoto K，Saito A，Hayashida N，Taguchi G，Matsumoto E.2008.Mapping of isolate-specific QTLs for clubroot resistance in Chinese cabbage（Brassica rapa L.ssp.pekinensis）.Theor Appl Genet，117：759-767.

Sanguinetti C J，Dias I，Neto E，Simpsor A J G.1994.Rapid silver staining and recovery of PCR products separated on polyacrylamide gels-polymerase chain reaction produel recovery.Biotechniques，17（5）：914-921.

Suwabe K，Tsukazaki H，Iketani H，Hatakeyama K，F(xiàn)ujimura M，Nunome T，F(xiàn)ukuoka H，Matsumoto S，Hirai M.2003.Identification of two loci for resistance to clubroot（Plasmodiophora brassicae Woronin）in Brassica rapa L.Theor Appl Genet，107：997-1002.

Suwabe K，Tsukazaki H，Iketani H，Hatakeyama K，Kondo M，F(xiàn)ujimura M，Nunome T，F(xiàn)ukuoka H，Hirai M，Matsumoto S.2006.Simple sequence repeat-based comparative genomics between Brassica rapa and Arabidopsis thaliana：the genetic origin of clubroot resistance.Genetics，173：309-319.

Wallenhammar A C.1996.Prevalence of Plasmodiophora brassicae in a spring oilseed rape growing area in central Sweden and factors influencing soil infestation levels.Plant Pathology，45：710-719.

Wang X W，Lou P，Bonnema G，Yang B J，He H J，Zhang Y G，F(xiàn)ang Z Y.2005.Linkage mapping of a dominant male sterility gene Ms-cd1 in Brassica oleracea.Genome，48：848-854.