HPLC-MSMS法快速鑒定Z/E馬來(lái)酸桂哌奇特異構(gòu)體

陳俊苗， 朱登勇， 王少敏， 張 凱， 李翠萍， 劉宏民

(1.鄭州大學(xué) 化學(xué)與分子工程學(xué)院 河南 鄭州 450052；2.鄭州大學(xué) 藥學(xué)院 河南 鄭州 450001)

0 引言

隨著藥物構(gòu)效關(guān)系研究的深入，藥物異構(gòu)體的分離分析日益被人們重視.高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法(HPLC-MSMS)集合液相色譜的高分離能力和質(zhì)譜的高靈敏度、高分辨能力于一體，是進(jìn)行同分異構(gòu)體檢查和藥物降解產(chǎn)物分析鑒定的強(qiáng)有力分析工具之一[1-3].馬來(lái)酸桂哌奇特(cinepazide maleate)是一種新型的治療心腦血管疾病的藥物(結(jié)構(gòu)式見(jiàn)圖1(a))，是一種鈣離子通道阻滯劑，同時(shí)具有對(duì)腺苷、cAMP增效的生物學(xué)作用[4].在馬來(lái)酸桂哌奇特的合成及儲(chǔ)存過(guò)程中，總伴隨有部分Z型異構(gòu)體雜質(zhì)(圖1(b))的生成[5]，但到目前為止分離檢測(cè)其Z/E型異構(gòu)體的報(bào)道很少，且檢出時(shí)間較長(zhǎng)[6].由于Z型異構(gòu)體價(jià)格昂貴且不易購(gòu)得，并且對(duì)照兩個(gè)分離峰的紫外色譜圖也不足確證它們?yōu)橐唤MZ/E異構(gòu)體.而采用HPLC-MSMS技術(shù)，通過(guò)對(duì)其E型主成分及其Z型異構(gòu)體雜質(zhì)的色譜和質(zhì)譜分析，可以在無(wú)對(duì)照品的情況下，對(duì)雜質(zhì)進(jìn)行快速確認(rèn)，并確保方法的可靠性.

圖1 E型馬來(lái)酸桂哌奇特主成分(a)及Z型異構(gòu)體雜質(zhì)(b)的結(jié)構(gòu)式Fig.1 Structures of E cinepazide maleate(a) and its Z isomer impurity (b)

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Micromass Q-Tof MicroTM高分辨質(zhì)譜儀(美國(guó)Waters公司)；Alliance HPLC 系統(tǒng)(美國(guó)Waters公司)：(1) 2695分離單元;(2) 2996光電二極管陣列檢測(cè)器，Waters MasslynxTM4.0軟件系統(tǒng).馬來(lái)酸桂哌奇特原料藥及E型、Z型對(duì)照品(鄭州大學(xué)新藥研發(fā)中心提供).乙腈為色譜純，乙酸銨、乙酸為分析純，18.2 MΩ超純水.

1.2 液相色譜/質(zhì)譜條件

Spherisorb C18柱(5 μm, 4.6 mm×200 mm) (天津市蘭博實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備有限公司)；流動(dòng)相：乙腈/乙酸銨緩沖溶液(稱(chēng)取無(wú)水乙酸銨0.70 g和冰乙酸0.15 g，加水至1 L，搖勻，pH=4.0) (20∶80, V /V );進(jìn)樣體積為10 μL；柱溫為30 ℃；流速為1 mL /min (柱后分流80%)；檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm.

電噴霧離子源(ESI)；正離子模式；毛細(xì)管電壓為3 000 V；錐孔電壓為30 V；源溫為80 ℃；干燥氣溫度為180 ℃；碰撞活化裂解(CAD)電壓為17 V；碰撞氣為Ar；掃描范圍為m/z50～600.

1.3 測(cè)試溶液的制備

馬來(lái)酸桂哌奇特原料藥首先在紫外燈下照射40 h，然后精確稱(chēng)取1 mg用100 mL流動(dòng)相定容后作為供試品溶液.

2 結(jié)果與討論

取1.3節(jié)制備的供試液按1.2節(jié)條件進(jìn)行HPLC-MSMS分析，通過(guò)對(duì)樣品進(jìn)行全掃描獲得樣品的總離子流圖(TIC)及提取離子流圖(EIC)(圖2).

圖2 E型桂哌奇特(Ⅱ)及其Z型異構(gòu)體(Ⅰ)的提取離子流圖(A)和總離子流圖(B)，Z型異構(gòu)體中m/z 418的二級(jí)質(zhì)譜(C)和E型桂哌奇特中m/z 418的二級(jí)質(zhì)譜(D)Fig.2 The corresponding extract ion chromatogram(A) and total ion chromatogram(B) of E cinepazide maleate( Ⅱ) and Z cinepazide maleate( Ⅰ )，MS/MS spectra of m/z 418 of Z cinepazide maleate in raw drugmaterial (C) and m / z 418 of E cinepazide maleate (D)

從供試品溶液總離子流圖中提取m/z418離子得到保留時(shí)間分別為4.68 min和5.82 min的兩個(gè)譜峰.分別對(duì)其積分處理發(fā)現(xiàn)它們的準(zhǔn)分子離子峰分別為m/z418.234 3和m/z418.234 0 (C22H32N3O5)，表明兩者為桂哌奇特同分異構(gòu)體.采用標(biāo)樣對(duì)比法對(duì)E型桂哌奇特主成分進(jìn)行確認(rèn)，可知圖2(A)和(B)中5.82 min處的譜峰為E型桂哌奇特(主成分).為進(jìn)一步獲得異構(gòu)體的結(jié)構(gòu)信息，選擇主成分和異構(gòu)體雜質(zhì)產(chǎn)生的準(zhǔn)分子離子m/z418進(jìn)行碰撞活化分解(CAD)得到結(jié)果如圖2(C)和(D).由圖可見(jiàn)：在相同質(zhì)譜條件下(注：裂解電壓為17 V)，兩者產(chǎn)生的主要碎片均有m/z319.2，m/z221.1，m/z198.2，m/z99.1；E型桂哌奇特主成分和Z型雜質(zhì)裂解峰中m/z99.1和m/z319.2的碎片豐度基本一致，而m/z198.2和m/z221.1的相對(duì)豐度卻差異很大:雖然雜質(zhì)和主成分的MSMS質(zhì)譜圖中碎片峰m/z221.1均為基峰，但雜質(zhì)中豐度為96%的碎片峰m/z198.2在主成分譜圖中僅為53%.推測(cè)是因?yàn)镋型桂哌奇特中雙鍵一端羰基的氧原子和雙鍵另一端的氫原子在雙鍵的同側(cè)易形成分子內(nèi)氫鍵(裂解途徑見(jiàn)圖3)，形成一個(gè)五元環(huán)過(guò)渡態(tài)從而使主成分中m/z221.1碎片離子較穩(wěn)定，以致其相對(duì)豐度可達(dá)到碎片離子m/z198.2的2倍，而Z型雜質(zhì)中雙鍵一端的羰基和另一端的氫原子處于反位不易形成這種過(guò)渡態(tài)使得兩個(gè)碎片的離子穩(wěn)定性相當(dāng)，因此兩碎片的豐度也相近.采用標(biāo)樣對(duì)比法對(duì)Z型雜質(zhì)進(jìn)行確認(rèn)也與此結(jié)果相吻合，從而證實(shí)了本文的推斷.

圖3 E型桂哌奇特的裂解過(guò)程Fig.3 Cleavage processes of E cinepazide

3 結(jié)論

研究結(jié)果表明，E型桂哌奇特主成分及其Z型異構(gòu)體雜質(zhì)由于空間結(jié)構(gòu)的不同，導(dǎo)致其裂解方式和二級(jí)質(zhì)譜圖也不同，可據(jù)此將兩者加以區(qū)分.應(yīng)用所建立的HPLC-MSMS法能使Z/E馬來(lái)酸桂哌奇特異構(gòu)體在沒(méi)有標(biāo)樣的情況下快速準(zhǔn)確地分離和鑒定.

參考文獻(xiàn)：

[1] Ermer J, Vogel M. Applications of hyphenated LC-MS techniques in pharmaceutical analysis[J].Biomed Chromatogr, 2000, 14 (6): 373-383.

[2] Wang S M, Bu S S, Liu H M, et al. Separation and characterization of clindamycin phosphate and related impurities in injection by liquid chromatography/electrospray ionization mass spectrometry[J]. Rapid Commun Mass Spectrom, 2009, 23(6): 899-906.

[3] 蘇永恒，張榕杰，冶保獻(xiàn). 固相萃取-超高效液相色譜-質(zhì)譜法測(cè)定蔬菜、水果中多菌靈[J]. 鄭州大學(xué)學(xué)報(bào)：醫(yī)學(xué)版，2010，45(3)：490-493.

[4] 張曉霞，韓培紅. 馬來(lái)酸桂哌奇特的藥理作用及臨床應(yīng)用研究[J]. 中國(guó)藥房，2007，18(26)：2060-2062.

[5] 劉華祥. 馬來(lái)酸桂哌齊特的制備及其光致順?lè)串悩?gòu)體研究[D]. 大連:大連理工大學(xué), 2009.

[6] 許晉星. RP-HPLC法測(cè)定馬來(lái)酸桂哌齊特片中有關(guān)物質(zhì)的含量[J]. 中國(guó)藥房，2009，20(1)：59-60.