豬博卡病毒PCR檢測(cè)方法的建立及其初步流行病學(xué)調(diào)查

胡軍勇，張 倩，王丹丹，涂志勤，胡睿銘，湯細(xì)彪，吳 斌*

(1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，湖北 武漢 430070；2.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物傳染病診斷中心，湖北 武漢 430070；3.農(nóng)業(yè)微生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 武漢 430070)

豬博卡病毒(Porcine Bocavirus，PBoV)屬于細(xì)小病毒科、博卡病毒屬，為單股線狀無(wú)囊膜DNA病毒，基因組約5200 bp[1]。到目前為止，博卡病毒屬包括：人博卡病毒(HBoV)、牛博卡病毒(BPV)、犬細(xì)小病毒(CnMV)、PBoV、大猩猩博卡病毒(GBoV)、黑猩猩博卡病毒(Chimpanzee bocavirus)[2]。博卡病毒首先在發(fā)生肺炎的嬰幼兒上呼吸道中被發(fā)現(xiàn)[1-2]。此外，在兒童急性病毒性腹瀉中檢測(cè)大量到HBoV，陽(yáng)性率僅次于輪狀病毒(Rotavirus)和星狀病毒(Astrovirus)[3]。目前已經(jīng)證實(shí)，多種博卡病毒，包括HBoV、BPV、CnMV、GBoV能夠感染并且導(dǎo)致宿主發(fā)生急性腹瀉[3-7]。2009年，Blomstrom等首先在斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征(PMWS)發(fā)病豬中發(fā)現(xiàn)PBoV[1]。流行病學(xué)調(diào)查證實(shí)，PBoV在患有呼吸系統(tǒng)疾病和PMWS的豬群的檢出率顯著高于健康豬群的檢出率[4-7]。程衛(wèi)霞等通過(guò)不依賴(lài)序列的單引物擴(kuò)增技術(shù)(SISPA-PCR)在健康豬群的糞便中檢測(cè)到PBoV。2010年，Shan等在無(wú)臨床癥狀的豬糞便樣品中檢測(cè)到PBoV的廣泛存在，陽(yáng)性率為63.2%[8]。這表明PBoV可以在豬腸道中定殖并散毒。目前，對(duì)于PBoV的致病性，感染豬的臨床表現(xiàn)，傳播機(jī)制等所知甚少[2,7,9]。

從2010年底開(kāi)始，國(guó)內(nèi)一些地區(qū)的豬場(chǎng)爆發(fā)了腹瀉疫情，以新生仔豬最為嚴(yán)重，癥狀表現(xiàn)為嘔吐、水樣腹瀉、體重下降及嚴(yán)重脫水，10日齡以下的仔豬癥狀最為嚴(yán)重，許多豬場(chǎng)的腹瀉發(fā)病率達(dá)到100%，哺乳仔豬的死亡率接近100%。目前，對(duì)于導(dǎo)致這波腹瀉疫情的病原尚無(wú)定論。近年來(lái)，多種與腹瀉相關(guān)的新型病毒被發(fā)現(xiàn)，其中PBoV在豬群中的高感染率已引起了廣泛關(guān)注[9-10]。但國(guó)內(nèi)尚無(wú)關(guān)于PBoV在腹瀉疫情中的流行狀況的文獻(xiàn)報(bào)道。

本研究建立了一種快速、敏感的檢測(cè)PBoV的PCR檢測(cè)方法，并應(yīng)用該方法針對(duì)湖北、湖南、河南省的不同豬群中采集樣品進(jìn)行PBoV的流行情況調(diào)查。為研究PBoV在腹瀉中的作用提供了相關(guān)的依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 重組質(zhì)粒、病毒株、菌株及臨床樣品 含有PBoV NS1基因的重組質(zhì)粒(pMD-PBoV-NS1)由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物傳染病診斷中心(簡(jiǎn)稱(chēng)：診斷中心)構(gòu)建；豬偽狂犬病毒(PRV)、豬細(xì)小病毒(PPV)、豬圓環(huán)病毒(PCV2)、沙門(mén)氏菌(Salmonella)、大腸桿菌(E.coli)、豬鏈球菌(S.suis)和副豬嗜血桿菌(Hps)由診斷中心保存，并按照基因組DNA提取試劑盒操作說(shuō)明提取其基因組；腹瀉樣品由診斷中心收集保存。按照基因組DNA提取試劑盒操作說(shuō)明提取其基因組。

1.2 PCR引物設(shè)計(jì)及標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性對(duì)照重組質(zhì)粒的構(gòu)建 根據(jù)GenBank中PBoV的NS1基因序列(HM053693、HM053694)設(shè)計(jì)1對(duì)引物。上游引物：5'-AGWCCTACGCCATCAGCAGCATC-3'；下游引物：5'-TCCCRCCTGCCAGGGATTGT-3'；預(yù)擴(kuò)增片段大小為482 bp。引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。從PBoV基因組中擴(kuò)增NS1基因目的序列；連接到pMD18-T載體中(pMD-PBo V)，轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)細(xì)胞后測(cè)序。

1.3 PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化 PCR擴(kuò)增體積為50 μL，其中包括：DNA模板4μL， ExTaq1 μL(5 U)，10×PCR 緩沖液 5 μL，上下游引物各 1 μL(10 μM)，dNTP 1 μL，加 ddH2O 至 50 μL，反應(yīng)條件為：94℃5 min；94℃ 30 s、56℃ 30 s、72℃ 60 s，35個(gè)循環(huán)；72℃7 min。根據(jù)以上的基本擴(kuò)增條件分別對(duì)退火溫度(52℃～62℃)和引物濃度范圍(0.2 μL～2.2 μL)進(jìn)行優(yōu)化。

1.4 特異性試驗(yàn) 應(yīng)用優(yōu)化的PCR擴(kuò)增條件分別對(duì)提純的 PRV、PPV、PCV2、Salmonella、E.coli、S.suis及Hps的基因組模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以驗(yàn)證該方法的特異性。

1.5 敏感性試驗(yàn) 采用重組質(zhì)粒作為標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性對(duì)照測(cè)試PCR方法的敏感性。通過(guò)紫外分光光度計(jì)檢測(cè)重組質(zhì)粒的OD值并根據(jù)公式計(jì)算其濃度，重組質(zhì)粒的濃度為5.34×1011拷貝/μL，將質(zhì)粒模板分別稀釋至10-1～10-10作為模板，按照建立的方法進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

1.6 PBoV在腹瀉疫情中的流行病學(xué)調(diào)查 從湖北、湖南、河南省的79個(gè)規(guī)?；i場(chǎng)采集的248份仔豬腹瀉臨床樣品，取腸道樣品200 mg放入2 mL離心管中，剪碎，然后加入1 mL生理鹽水，混勻并且勻漿處理5 min。勻漿后將樣品離心，6000 r/min離心5 min，4℃，取勻漿好的樣品200 μL，參照基因組DNA提取試劑盒操作說(shuō)明提取樣品總DNA。采用優(yōu)化的PCR檢測(cè)方法進(jìn)行擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物以2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.7 PBoV在不同豬群中的分布調(diào)查 從4個(gè)發(fā)生腹瀉的規(guī)?；i場(chǎng)對(duì)不同豬群隨機(jī)采集糞便樣品，并詳細(xì)記錄豬場(chǎng)的流行病學(xué)狀況。具體采樣方案及樣品對(duì)應(yīng)的臨床癥狀見(jiàn)表1。應(yīng)用PCR方法調(diào)查不同豬群中PBoV的分布，分析PBoV與和臨床腹瀉癥狀的關(guān)聯(lián)。

2 結(jié)果

2.1 PCR檢測(cè)方法反應(yīng)條件的優(yōu)化

2.1.1 退火溫度優(yōu)化結(jié)果 以含有PBoV NS1基因的重組質(zhì)粒pMD-PBoV-NS1為模板，通過(guò)特異性引物，采用不同的擴(kuò)增溫度進(jìn)行擴(kuò)增。其中，在58℃時(shí)，擴(kuò)增效果最佳所以選擇58℃作為最適宜退火溫度(圖1)。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物約500 bp，與預(yù)期片段(482 bp)相符。

圖1 退火溫度優(yōu)化結(jié)果Fig.1 The optimization of annealing temperature

2.1.2 引物濃度優(yōu)化結(jié)果 按照優(yōu)化的退火溫度，采用不同的引物濃度進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其中在1.0 μL(10 μM)引物時(shí)擴(kuò)增效果最佳(圖2)，并選擇作為最佳引物用量。

圖2 引物用量?jī)?yōu)化結(jié)果Fig.2 The optimization of primer concentration

2.1.3 PCR最終反應(yīng)體系 cDNA模板4 μL，Ex-Taq1 μL，10×PCR 緩沖液 5 μL，上下游引物各1 μL，dNTP 2 μL，加 ddH2O 至 50 μL。反應(yīng)條件為：94℃5 min；94℃30 s、58℃30 s、72℃ 60 s，35個(gè)循環(huán)；72℃7 min。

2.2 特異性試驗(yàn)結(jié)果 應(yīng)用建立的檢測(cè)方法分別對(duì)PRV、PPV、PCV2、Salmonella、E.coli、S.suis及Hps的基因組DNA進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果只能從PBoV陽(yáng)性樣品中擴(kuò)增出相應(yīng)大小的片段，其他病毒樣品均無(wú)擴(kuò)增片段(圖3)。

圖3 特異性試驗(yàn)結(jié)果Fig.3 The specific test of the PCR assay

2.3 敏感性試驗(yàn)結(jié)果 將重組質(zhì)粒分別稀釋為10-1～10-10作為模板，均能夠擴(kuò)增出目的條帶，但亮度隨著稀釋倍數(shù)的增加而遞減，并且最低檢出DNA的量為213.6拷貝 (圖4)。

圖4 敏感性試驗(yàn)結(jié)果Fig.4 The sensitivity test of the PCR assay

2.4 臨床腹瀉樣品檢測(cè)結(jié)果 從湖北、湖南、河南省79個(gè)規(guī)?；i場(chǎng)采集的248份仔豬腹瀉樣品，應(yīng)用PCR方法檢測(cè)PBoV，結(jié)果172份樣品為陽(yáng)性，陽(yáng)性率為69.35%，PBoV陽(yáng)性的豬場(chǎng)數(shù)為67個(gè)，陽(yáng)性率為84.81%。

2.5 PBoV感染在不同豬群中的分布調(diào)查 對(duì)4個(gè)發(fā)生腹瀉的規(guī)?；i場(chǎng)的不同豬群隨機(jī)采樣。應(yīng)用PCR方法檢測(cè)不同豬群中PBoV的分布，結(jié)果見(jiàn)表1。共采集188份樣品，其中腹瀉的豬有119頭。檢測(cè)結(jié)果顯示PBoV陽(yáng)性的樣品有121份。在這121份陽(yáng)性樣品中，共有88份樣品對(duì)應(yīng)的豬發(fā)生腹瀉。因此，所有樣品的PBoV陽(yáng)性率為64.36%(121/188)，其中腹瀉豬的PBoV陽(yáng)性率為88/119(73.95%)，非腹瀉豬的PBoV陽(yáng)性率為33/69(47.83%)。根據(jù)表1的結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)PBoV與豬場(chǎng)的腹瀉癥狀有比較一致的對(duì)應(yīng)關(guān)系。

表1 4個(gè)規(guī)?；i場(chǎng)PBoV陽(yáng)性率及腹瀉發(fā)病情況Table 1 PBoV positive rates in various pig groups with or without diarrhea

3 討論

國(guó)內(nèi)一些地區(qū)自2010年底開(kāi)始，許多豬場(chǎng)發(fā)生仔豬腹瀉疫情，而且持續(xù)不斷，疫情波及全國(guó)。這次腹瀉疫情的發(fā)病率、死亡率和持續(xù)時(shí)間遠(yuǎn)超往年的平均水平。目前對(duì)于導(dǎo)致這次腹瀉疫情的病原尚無(wú)定論。有文獻(xiàn)報(bào)道，在發(fā)生腹瀉的豬群中流行性腹瀉病毒的陽(yáng)性率高達(dá)82.0%，相反其他常見(jiàn)腹瀉類(lèi)病毒，如豬傳染性胃腸炎、豬輪狀病毒的陽(yáng)性率則要低很多[11-12]。由此推測(cè)，豬流行性腹瀉病毒很有可能在這次腹瀉疫情中起到極其重要作用；但并不能排除其他病原混合感染，協(xié)同感染的可能。目前已經(jīng)證實(shí)，多種博卡病毒，包括HBoV、BPV、Cn-MV、GBoV能夠感染并且導(dǎo)致宿主發(fā)生急性腹瀉[11-12]。但對(duì)于PBoV是否是導(dǎo)致腹瀉的病原仍然有爭(zhēng)議[7,13-14]。本研究根據(jù)PBoV的NS1基因序列設(shè)計(jì)了簡(jiǎn)并性引物，并建立了PBoV PCR檢測(cè)方法。通過(guò)優(yōu)化反應(yīng)條件和反應(yīng)程序，PBoV PCR檢測(cè)方法的最低檢出量為213.6拷貝，而且具有良好特異性；在248份臨床樣品中也沒(méi)有出現(xiàn)任何非特異性擴(kuò)增的雜帶。結(jié)果表明本研究建立的PCR檢測(cè)方法具有良好的穩(wěn)定性、特異性、敏感性；該方法可以用于臨床診斷和流行病學(xué)調(diào)查提供了有力的支持。

流行病學(xué)調(diào)查的結(jié)果顯示，在248份腹瀉樣品中，PBoV的陽(yáng)性率達(dá)到69.35%，表明在發(fā)生腹瀉豬的腸道內(nèi)PBoV的感染非常普遍。在此基礎(chǔ)上，我們又深入調(diào)查了PBoV在各個(gè)豬群中的分布，結(jié)果顯示在非腹瀉豬中PBoV的陽(yáng)性率只有48.73%，而在發(fā)生腹瀉的豬群中PBoV的陽(yáng)性率高達(dá)73.95%，顯著高于非腹泄豬群。PBoV在新生仔豬中的陽(yáng)性率最高，其次是種豬和育肥豬；保育豬的陽(yáng)性率最低，這個(gè)分布與這次腹瀉疫情高發(fā)豬群的分布基本一致，但該結(jié)果與Zhai等的結(jié)果相反[14]。Zhai的樣品采集專(zhuān)門(mén)針對(duì)的是PMWS，而PMWS發(fā)生在斷奶仔豬群，而我們的檢測(cè)針對(duì)的是腹瀉疫情，而腹瀉疫情往往集中發(fā)生在新生仔豬和母豬。從這個(gè)角度分析，PBoV集中分布于發(fā)病群體中。因此，可以推斷PBoV與目前的腹瀉疫情有一定的相關(guān)性。但目前的數(shù)據(jù)不足以證明PBoV是否為原發(fā)性病原，或者起到協(xié)同感染的作用。還需要進(jìn)一步的病毒分離和病例復(fù)制等方法提供直接的病原學(xué)證據(jù)。目前這項(xiàng)工作正在進(jìn)行中。

[1]Blomstro¨m A L,Belák S,Fossum C,et al.Detection of a novel porcine boca-like virus in the background of porcine circovirus type 2 induced postweaning multisystemic wasting syndrome[J].Virus Res,2009,146(1-2):125-129.

[2]Allander,T,Human bocavirus[J].J Clin Virol,2008,41(1):29-33.

[3]Arthur J L,Higgins G D,Davidson G P,et al.A novel bocavirus associated with acute gastroenteritis in Australian children[J].PLoS Pathog,2009,5(4):e1000391.

[4]Blomstro¨m A L,Belák S,Fossum C,et al.Studies of porcine circovirus type 2,porcine boca-like virus and torque teno virus indicate the presence of multiple viral infections in postweaning multisystemic wasting syndrome pigs[J].Virus Res,2010,152(1-2):59-64.

[5]Huang Lv,Zhai Shao-Lun,Cheung A K,et al.Detection of a novel porcine parvovirus,PPV4,in Chinese swine herds[J].Virol J,2010,7:333-338.

[6]Madec F,Rose N,Grasland B,et al.Post-weaning multisystemic wasting syndrome and other PCV2-related problems in pigs:a 12-year experience[J].Transbound Emerg Dis,2008,55(7):273-283.

[7]Meng,X J,Emerging and re-emerging swine viruses[J].Transbound Emerg Dis,2012,9(10):1865-1682.

[8]Shan Tong-ling,Lan Dao-liang,Li Lin-lin,et al.Genomic characterization and high prevalence of bocaviruses in swine[J].PLoS One,2011.6(4):e17292.

[9]McKillen J,McNeilly F,Duffy C,et al.Isolation in cell cultures and initial characterisation of two novel bocavirus species from swine in Northern Ireland[J].Vet Microbiol,2011,152(1-2):39-45.

[10]Li Bin,Xiao Shao-bo,Ma Jun-jie,et al.Development of a novel TaqMan-based real-time PCR assay for the detection of porcine boca-like virus(Pbo-likeV)[J].Virol J,2011,8:357-311.

[11]Chen Jian-fei,Liu Xiao-zhen,Shi Da,et al.Complete genome sequence of a porcine epidemic diarrhea virus variant[J].J Virol,2012,86(6):3408-3412.

[12]Sun Rui-Qin,Cai Ru-Jian,Chen Ya-Qiang,et al.Outbreak of porcine epidemic diarrhea in suckling piglets,China[J].Emerg Infect Dis,2012,18(1):161-163.

[13]Cheng Wei-Xia,Li Jin-Song,Huang Can-Ping,et al.Identification and nearly full-length genome characterization of novel porcine bocaviruses[J].PLoS One,2010,5(10):e13583.

[14]Zhai Shao-Lun,Yue Cheng,Wei Zu-zhang,et al.High prevalence of a novel porcine bocavirus in weanling piglets with respiratory tract symptoms in China[J].Arch Virol,2010,155(8):1313-1317.