禽多殺性巴氏桿菌C48-3株hexABC基因缺失株的構(gòu)建及其生物學(xué)特性分析

吾魯木汗·那孜爾別克，張宇鳳，龔鳳娟，恩特馬克·布拉提白

(吉首大學(xué)生物資源與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，湖南 吉首 416000)

禽霍亂是一種主要由血清型A:1、A:3或A:4多殺性巴氏桿菌(Pasteurella multocida)引起的家禽和野生鳥類的接觸性傳染病，給養(yǎng)禽業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟損失[1]。目前，預(yù)防禽霍亂的主要措施是接種禽P.multocida的滅活苗和活菌苗。研究表明，強毒株制備的滅活苗只對同源菌株的感染具有保護(hù)作用，而弱毒株制備的活菌苗雖對同源菌株和異源菌株的感染具有一定的交叉保護(hù)作用，但存在毒力返強的缺點。因此，研究禽P.multocida致病因子及其致病機理，對研制安全有效的活菌苗極為重要。

研究表明細(xì)菌莢膜是致病菌的主要毒力因子[2]。Pruimboom等的研究表明莢膜透明質(zhì)酸是禽P.multocida的粘附因子[3]。Chung等的研究表明禽P.multocidaX-73株莢膜基因位點由莢膜多糖輸出蛋白基因hexABCD、莢膜多糖合成酶基因hyaABCDE和莢膜多糖修飾酶基因phyAB等11個開放閱讀框組成，而hexA基因的缺失突變導(dǎo)致禽P.multocidaX-73株對小鼠或雞的毒力減弱[4-5]。本實驗以禽P.multocida C48-3株為研究對象，采用基因敲除技術(shù)構(gòu)建了hexABC基因缺失突變株，通過小鼠致病性試驗檢驗莢膜缺陷對禽P.multocida毒力的影響，為進(jìn)一步開展禽P.multocida致病機理的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 菌株、質(zhì)粒及實驗動物 血清型A∶1禽P.multocidaC48-3株(CVCC458)購自中國獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心；大腸桿菌DH5α、pBR322和pMD18-T載體購自TaKaRa公司；多功能低拷貝質(zhì)粒pWSK29[6]由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所秦鄂德教授惠贈；5周齡雌性清潔級昆明系小鼠購自中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院實驗動物學(xué)部。

1.2 主要試劑 限制性內(nèi)切酶、DNA連接試劑盒、ExTaqDNA聚合酶、質(zhì)粒提取試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒、PCR產(chǎn)物純化試劑盒及細(xì)菌基因組提取試劑盒均購自TaKaRa公司；RNA prep pure培養(yǎng)細(xì)胞/細(xì)菌總RNA提取試劑盒和Quant cDNA第一鏈合成試劑盒購自北京天根生化科技公司；透明質(zhì)酸酶購自Worthington公司；鐵蛋白購自Sigma公司；DSA培養(yǎng)基購自Difco公司。

1.3 引物設(shè)計與合成 根據(jù)GenBank中登錄的禽P.multocidaPm70株全基因組序列(AF06727)、pBR322質(zhì)粒序列和pWSK29質(zhì)粒的多克隆位點(AF01889)，采用Primer premier 5.0軟件設(shè)計3對引物(表1)，由TaKaRa公司合成。

表1 PCR引物序列Table 1 Oligonucleotide primers

1.4 C48-3株hexABC基因的克隆和測序 將菌株C48-3接種于TB液體培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)18 h，采用細(xì)菌基因組提取試劑盒制備基因組DNA。以HexC-F/HexA-R為引物由C48-3株基因組DNA中擴增編碼莢膜透明質(zhì)酸輸出蛋白A、B、C的hexABC基因。反應(yīng)條件為：94℃5 min；94℃30 s、67℃30 s、72℃2 min，35個循環(huán)；72℃ 10 min。凝膠回收PCR產(chǎn)物，以SacⅡ和KpnⅠ進(jìn)行雙酶切，并連接到pWSK29質(zhì)粒中，構(gòu)建重組質(zhì)粒pWSK29-hexABC，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α。經(jīng)PCR和酶切鑒定并由TaKaRa公司進(jìn)行測序。

1.5 敲除質(zhì)粒的構(gòu)建 以Tet-F/Tet-R為引物由pBR322質(zhì)粒中擴增1191 bp的四環(huán)素抗性(TetR)基因。反應(yīng)條件為：94℃ 5 min；94℃ 30 s、68℃30 s、72℃1 min，35個循環(huán)；72℃ 10 min。純化PCR產(chǎn)物，以ClaⅠ和PstⅠ酶切并連接至重組質(zhì)粒pWSK29ΔhexABC中hexC基因的PstⅠ和hexA基因的ClaⅠ位點，構(gòu)建敲除質(zhì)粒pWSK29ΔhexABC。經(jīng)PCR鑒定并由TaKaRa公司進(jìn)行測序。

1.6 突變株的構(gòu)建 參照文獻(xiàn)[7]方法制備C48-3株感受態(tài)細(xì)胞。在2.5 kV/cm、600 Ω和25 μF電轉(zhuǎn)參數(shù)下，將10 μg敲除質(zhì)粒pWSK29ΔhexABC電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，并涂布于含有5 μg/mL四環(huán)素的DSA平板上，37℃培養(yǎng)48 h。隨機挑取8個單菌落，以引物HexC-IN/HexA-IN進(jìn)行PCR擴增。

1.7 突變株的交叉引物PCR和序列鑒定 為驗證hexABC基因是否被四環(huán)素抗性基因替代而缺失，分別以引物HexC-F/HexA-R、HexC-F/Tet-R、Tet-F/HexA-R、Tet-F/Tet-R、HexC-IN/HexA-IN對突變株基因組DNA進(jìn)行交叉PCR驗證。同時，將以引物HexC-F/HexA-R擴增的PCR產(chǎn)物克隆于pMD18-T中，經(jīng)PCR和酶切鑒定并進(jìn)行測序鑒定。

1.8 突變株的RT-PCR鑒定 將野生株和突變株分別接種于TB培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)18 h，離心收集菌體，采用細(xì)菌總RNA提取試劑盒提取RNA，以其為模板采用Random Octamers和Quant Reverse Transcriptase合成cDNA第一鏈，并利用針對目的基因內(nèi)部序列的HexC-IN/HexA-IN引物進(jìn)行PCR擴增，瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.9 突變株的電鏡觀察 參照文獻(xiàn)[8]方法以環(huán)氧樹脂包埋菌體，制備超薄切片，水化醋酸雙氧鈾和檸檬酸鉛染色，透射電鏡觀察細(xì)菌莢膜結(jié)構(gòu)。

1.10 突變株生物學(xué)特性研究 將菌培養(yǎng)于DSA平板(37℃24 h)，觀察細(xì)菌菌落形態(tài)，并對單菌落進(jìn)行革蘭氏染色。將菌株接種于TB培養(yǎng)基37℃培養(yǎng)過夜，次日以1%接種量接種于TB培養(yǎng)基37℃培養(yǎng)，每間隔1 h測定OD600nm值，直至細(xì)菌生長處于穩(wěn)定期，繪制生長曲線。

1.11 對小鼠的致病性試驗 通過動物實驗檢測禽P.multocidaC48-3株對SPF級昆明系小鼠的半數(shù)致死量(LD50)，結(jié)果顯示菌株C48-3對昆明系小鼠的LD50為6.7 cfu。將30只5周齡昆明系小鼠隨機分為3組，每組10只。C48-3株和突變株在TB培養(yǎng)基中培養(yǎng)至OD600nm值為1.0，稀釋制備3.45×103cfu/mL的菌液，取0.1 mL(50 LD50約為345 cfu)腹腔注射小鼠，陰性對照組小鼠腹腔注射相同體積的TB培養(yǎng)基，連續(xù)觀察7 d，記錄小鼠死亡情況。

2 結(jié)果

2.1 C48-3株hexABC基因的序列分析 以引物HexC-F/HexA-R由C48-3株基因組中擴增出大小約為2000 bp的DNA片段(圖1)，與預(yù)期值相符。DNA測序結(jié)果表明，重組質(zhì)粒pWSK29-hexABC含有2073 bp的插入片段，其 5'端含有 620 bp的hexC基因下游序列、中間含有798 bp的hexB基因全序列、3'端含有660 bp的hexA基因全序列，與已報道的禽 P.multocidaX-73株[7]和 Pm70株 hex-ABC基因核苷酸序列同源性為99%。并且C48-3株hexC基因終止密碼子與hexB(JF276224)基因的起始密碼子間存在1個堿基重疊，hexB基因的終止密碼子與hexA(JF276225)基因起始密碼子間存在4個堿基重疊。

圖1 禽P.multocidaC48-3株hexABC基因片段的PCR擴增Fig.1 PCR amplification of thehexABCgenes from avian P.multocidaC48-3

2.2 敲除質(zhì)粒的構(gòu)建 以引物Tet-F/Tet-R由pBR322質(zhì)粒DNA中擴增出1191 bp的TetR基因，并連接至重組質(zhì)粒pWSK29-hexABC的ClaⅠ和PstⅠ位點，構(gòu)建敲除質(zhì)粒 pWSK29ΔhexABC。以引物HexC-F/HexA-R由重組質(zhì)粒pWSK29-hexABC和敲除質(zhì)粒pWSK29ΔhexABC中分別擴增出大小約為2000bp和1900 bp的DNA片段，以引物Tet-F/Tet-R從敲除質(zhì)粒pWSK29ΔhexABC中擴增出大小約為1200 bp的片段，與預(yù)期值相符(圖2)。DNA測序結(jié)果表明，TetR基因的上游存在366 bp的hexC基因同源序列，下游存在366 bp的hexA基因同源序列。結(jié)果表明構(gòu)建了敲除質(zhì)粒pWSK29ΔhexABC。

2.3 突變株的構(gòu)建 將敲除質(zhì)粒pWSK29ΔhexABC電轉(zhuǎn)化C48-3株感受態(tài)細(xì)胞，轉(zhuǎn)化子涂布于含有四環(huán)素的DSA平板上培養(yǎng)，以引物HexC-IN/HexA-IN對疑似突變株進(jìn)行菌落PCR篩選。PCR結(jié)果顯示，以引物HexC-IN/HexA-IN從野生型C48-3基因組中擴增出約1300 bp片段，在8個轉(zhuǎn)化子中有3個菌株擴增結(jié)果為陰性，選擇1株疑似突變株做進(jìn)一步驗證。

2.4 突變株的鑒定 通過交叉引物PCR鑒定突變株的基因組DNA。以引物HexC-F/HexA-R擴增出約為1900 bp的片段，以引物HexC-F/Tet-R或Tet-F/HexA-R擴增出約1500 bp的片段，以引物Tet-F/Tet-R擴增出約1190 bp的片段，以引物HexC-IN/HexA-IN未能擴增任何片段，表明同源重組可能產(chǎn)生(圖3)。同時，對引物HexC-F/HexA-R擴增得到的PCR產(chǎn)物進(jìn)行克隆，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，并對重組質(zhì)粒進(jìn)行測序。測序結(jié)果表明，通過同源重組從突變株基因組中敲除253 bp的hexC基因下游序列、798 bp的hexB基因全序列和290 bp的hexA基因上游序列。這些結(jié)果表明通過基因敲除技術(shù)構(gòu)建了C48-3株的hexABC缺失突變株，并命名為C48-3ΔhexABC。

圖2 敲除載體pWSK29△hexABC的PCR鑒定Fig.2 PCR identification of the knockout vector pWSK29△hexABC

圖3 突變株C48-3△hexABC基因組DNA的交叉PCR鑒定Fig.3 Cross-PCR analysis of genomic DNA from mutant C48-3△hexABC

2.5 突變株的RT-PCR鑒定 采用逆轉(zhuǎn)錄酶分別對突變株和野生株RNA進(jìn)行cDNA合成，并以其為模板，采用針對目的基因內(nèi)部序列的引物HexCIN/HexA-IN進(jìn)行PCR擴增。通過RT-PCR從野生株C48-3中擴增出約1300 bp的片段，表明hexABC基因正常轉(zhuǎn)錄；而在突變株C48-3ΔhexABC中為陰性，在轉(zhuǎn)錄水平上表明敲除了hexABC基因(圖4)。

圖4 突變株C48-3△hexABC的RT-PCR鑒定Fig.4 RT-PCR analysis of mutant C48-3△hexABC

2.6 突變株的電鏡觀察 野生株C48-3細(xì)胞壁表面存在較完整的莢膜層，但突變株C48-3ΔhexABC細(xì)胞壁表面未見莢膜結(jié)構(gòu)(圖5)。表明hexABC基因的缺失突變打斷了莢膜透明質(zhì)酸的胞外運送，這一結(jié)果也從細(xì)胞水平上證實敲除了hexABC基因。

圖5 野生株C48-3(A)和突變株C48-3△hexABC(B)的電鏡觀察Fig.5 Electron micrographs of ferritin-stained thin section of P.multocidaC48-3(A)and mutant C48-3△hexABC(B)

2.7 突變株生物學(xué)特性分析 將菌株接種于DSA平板37℃培養(yǎng)過夜，觀察菌落形態(tài)特征。結(jié)果顯示，野生株和突變株在DSA平板上的菌落均為淡灰白色、圓形、邊緣整齊，與野生株相比，突變株長出非粘性小菌落。革蘭氏染色顯示，野生株和突變株均為陰性，菌體形態(tài)為球桿狀或短桿狀，外觀無明顯變化。野生株C48-3和突變株C48-3ΔhexABC生長特性的比較結(jié)果表明兩者生長速率無明顯差異，但突變株對數(shù)期生長速率遲緩，進(jìn)入平臺期的細(xì)菌密度值比野生株低(圖6)。

圖6 野生株C48-3和突變株C48-3△hexABC的生長曲線Fig.6 Growth curves ofP.multocidaC48-3 and mutant C48-3△hexABC

2.8 對小鼠致病性試驗 野生株C48-3注射組10只小鼠在感染后第2 d開始死亡，至第3 d小鼠全部死亡，剖檢死亡小鼠肝臟、腎臟和肺等主要器官出現(xiàn)不同程度的出血；突變株C48-3ΔhexABC注射組的10只小鼠均未表現(xiàn)任何發(fā)病癥狀，健康狀況良好；陰性對照組小鼠狀態(tài)均良好。結(jié)果表明莢膜缺陷突變株喪失了對小鼠的致病性。

3 討論

Chung等采用PSORT軟件預(yù)測X-73株Hex-ABCD蛋白的分選信號和分布位置，結(jié)果顯示，HexA蛋白可能是具有ATP結(jié)合功能的莢膜多糖輸出蛋白，HexB蛋白是具有莢膜多糖輸出功能的內(nèi)膜蛋白，而HexC蛋白和HexD蛋白分別為內(nèi)膜蛋白和外膜蛋白，但它們的生物學(xué)功能尚不清楚[5]。Chung等利用基因敲除技術(shù)構(gòu)建X-73株hexA基因的缺失突變株并檢測其對小鼠的致病性，結(jié)果顯示突變株對小鼠的毒力降低了106倍[9]。

本研究由禽P.multocidaC48-3株基因組中擴增出hexABC基因片段，并對PCR產(chǎn)物進(jìn)行克隆和測序，結(jié)果顯示被克隆的DNA片段含有hexAB基因的全序列和hexC基因的部分序列，與已發(fā)表的禽P.multocidaX-73株[5]和Pm70株[6]hexABC基因的同源性均為99%，表明hexABC基因在血清型A∶1和A∶3禽P.multocida菌株中具有很高的同源性。為進(jìn)一步研究莢膜的致病性，采用基因敲除技術(shù)構(gòu)建禽P.multocidaC48-3株hexABC基因的缺失突變株，對突變株進(jìn)行的PCR、RT-PCR和DNA測序結(jié)果表明突變株構(gòu)建成功。電鏡觀察結(jié)果顯示，與野生株C48-3和Chung等[9]構(gòu)建的突變株P(guān)BA930相比，突變株C48-3ΔhexABC的菌體表面未見莢膜結(jié)構(gòu)，顯示除hexA基因外，hexBC基因也在莢膜多糖的胞外運輸過程中發(fā)揮一定的作用。生物學(xué)特性比較顯示，與野生株相比突變株在DSA平板上長出非粘性小菌落，對數(shù)期生長速率遲緩，而它們的菌體外觀無明顯變化。小鼠的致病性試驗結(jié)果表明，hexABC基因的缺失突變顯著影響禽P.multocidaC48-3株的毒力，即小鼠接種345 cfu的突變株C48-3ΔhexABC時未能導(dǎo)致小鼠的死亡，而Chung等經(jīng)腹腔注射小鼠1.3×108cfu的hexA基因的缺失突變株P(guān)BA930時仍未導(dǎo)致小鼠死亡[9]，由此可以推測本實驗所使用的突變株菌量尚未達(dá)到小鼠死亡的劑量。鑒于雞為血清A∶1禽P.multocida的天然宿主，本實驗還需要通過SPF雞模型對hexABC基因做進(jìn)一步研究，以期闡明莢膜在禽P.multocida致病過程中的作用，為禽P.multocida致病機理的研究和防治提供參考。

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