綠原酸對阻塞性黃疸大鼠肝纖維化的治療作用及其機制

黃偉煒 陳一明 宮曉光 劉寧 伍海鷹 王保春 常順伍

咖啡是茜草科多年生常綠小喬木咖啡樹種子的加工產(chǎn)品，研究表明，咖啡中的生物活性物質(zhì)具有明顯的肝臟保護作用，咖啡的消耗量與肝纖維化和肝硬化的發(fā)病率均呈負相關(guān)[1-2]。綠原酸(chlorogenic acid，CGA)和咖啡因是咖啡中的主要活性物質(zhì)。CGA屬于酚類抗氧化劑，有清除超過氧化物陰離子及抑制過氧化物活性的作用，還可以抑制乙肝病毒表面抗原，抑制和殺滅多種致病菌和病毒，并具有抗腫瘤、抑制突變、保肝利膽、降血壓以及降血脂等功能[3-4]。

本實驗建立了阻塞性黃疸大鼠模型，應用CGA對模型鼠進行干預，從肝臟超微結(jié)構(gòu)和分子水平上檢測和觀察CGA對大鼠肝纖維化的影響，旨在研究CGA對大鼠肝纖維化的治療作用及其機制。

1 材料與方法

1.1 動物

清潔級SD大鼠，雄性，體重(260±20)g，購自海南省人民醫(yī)院實驗動物中心。

1.2 儀器及試劑

島津CL-7200全自動生化分析儀，Bio-Rad核酸與蛋白電泳儀，小鼠抗大鼠Bax和bcl-2單克隆抗體、辣根過氧化物酶標記的綿羊抗小鼠單克隆II抗，總RNA提取試劑盒，RT-PCR引物等。

1.3 動物模型的制作

雄性SD大鼠72只，隨機分成假手術(shù)組、模型組和綠原酸治療組，每組24只。(1)假手術(shù)組(膽總管不結(jié)扎+生理鹽水組，SO組)：術(shù)前禁食12小時，禁飲4小時，腹腔內(nèi)注射氯氨酮(100 mg/kg)麻醉。無菌操作，取上腹部正中切口，長約2 cm，僅分離、顯露膽總管，逐層關(guān)腹。術(shù)后6小時，腹腔內(nèi)注射生理鹽水(2 ml/kg，1次/天)；(2)模型組(膽總管結(jié)扎+生理鹽水組，BDL+NS組)：分離、顯露膽總管后，于十二指腸上緣用2/0絲線雙重結(jié)扎膽總管，在兩結(jié)扎線間切斷，并剪去少許膽總管，然后逐層關(guān)腹。術(shù)后6小時，腹腔內(nèi)注射NS (2 ml/kg，1次/天)；(3)綠原酸治療組(膽總管結(jié)扎+綠原酸組，BDL+CGA組)：膽總管結(jié)扎方法與模型組相同。術(shù)后6小時，腹腔內(nèi)注射綠原酸(40 mg/kg, 1次/天)。每組術(shù)后再隨機分設7天、14 天和21天共3個時相點，每個時相點8只實驗鼠。分籠普通飼養(yǎng)，自由進水進食。

1.4 檢測方法和觀察指標

1.4.1 血清的酶學檢測 大鼠開腹，充分暴露下腔靜脈，以5 ml無菌注射器從下腔靜脈取血3 ml，常溫下1200 r/min離心3 分鐘，收集血清，全自動生化分析儀檢測大鼠肝功能指標谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、總膽紅素(TBIL)。

1.4.2 形態(tài)學觀察 取肝組織塊，經(jīng)過固定，包埋，切片，脫水，透明和封片后，用蘇木素-伊紅(HE)染色，光鏡觀察。

1.4.3 Western blot檢測bcl-2和Bax 取肝組織，Western blot檢測抑凋亡因子bcl-2、促凋亡因子Bax在蛋白質(zhì)水平的表達(β-actin為內(nèi)參)[5]。

1.4.4 RT-PCR檢測bcl-2和Bax 用TRIzol試劑提取肝組織細胞的總RNA，RT-PCR法檢測bcl-2、Bax在mRNA水平的表達(β-actin為內(nèi)參)，引物序列見表1。PCR反應條件：94 ℃預變性5分鐘，然后進行35個循環(huán)組成的擴增反應。每次循環(huán)包括：94 ℃變性30秒，55 ℃退火30秒，72 ℃延伸30秒，最后72 ℃延伸10分鐘。2%瓊脂糖凝膠電泳分離RT-PCR產(chǎn)物，采用Total lab 120分析軟件測定灰度，對PCR產(chǎn)物進行半定量分析。

1.4.5 RT-PCR檢測I型、III型膠原 用TRIzol試劑提取肝組織總RNA，RT-PCR法檢測I型膠原(collagen I， Co I)、III型膠原(collagen III， Co III)在mRNA水平的表達(β-actin為內(nèi)參)，PCR引物序列見表1。RT-PCR反應條件同1.4.4。3%瓊脂糖凝膠電泳分離RT-PCR產(chǎn)物，采用Total lab 120分析軟件測定灰度，對PCR產(chǎn)物進行半定量分析。

1.5 統(tǒng)計學方法

2 結(jié)果

2.1 肝功能測定結(jié)果

7天、14天和21天時，BDL+NS和BDL+CGA組的ALT、AST、TBIL值均顯著高于SO組(P<0.01)；7天、14天時，BDL+CGA組的ALT、AST、TBIL值顯著低于BDL+NS組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；21天時，BDL+CGA組的ALT、AST、TBIL值低于BDL+NS組，但差異不顯著(P>0.05)。見表2～4。

表1 內(nèi)參基因和目標基因的引物序列

表2 各組大鼠不同時間點ALT含量變化(U/L)

注：與SO組相比，aP<0.01；與BDL+NS組相比，bP<0.01，cP<0.05，dP>0.05。

表3 各組大鼠不同時間點AST含量變化(U/L)

注：與SO組相比，aP<0.01；與BDL+NS組相比，bP<0.05，cP>0.05。

表4 各組大鼠不同時間段TBIL含量變化(μmol/L)

注：與SO組相比，aP<0.01；與BDL+NS組相比，bP<0.05，cP>0.05。

2.2 形態(tài)學結(jié)果

SO組肝組織未見異常。BDL+NS組膽管結(jié)扎7天時，肝細胞出現(xiàn)點狀壞死和少量纖維組織增生；膽管結(jié)扎14天時肝小葉內(nèi)可見多種形態(tài)的壞死灶，周圍炎性細胞浸潤，纖維組織及小膽管廣泛增生，竇間隙及肝竇中炎癥細胞增多；膽管結(jié)扎21天時肝組織增生更明顯，結(jié)構(gòu)紊亂呈肝硬化特征。BDL+CGA組在7、14天時肝組織病理改變均較BDL+NS組輕；21天時，BDL+NS組與BDL+CGA組2組差異不明顯。

2.3 Bax、bcl-2在蛋白水平的表達

SO組Bax、bcl-2蛋白表達均呈較低水平表達。在各時間點，BDL+NS組與BDL+CGA組大鼠肝組織Bax蛋白量較SO組高，但BDL+CGA組與BDL+NS組間差異不明顯；在各時間點，BDL+NS組與BDL+CGA組大鼠肝組織bcl-2蛋白量較SO組高，并且BDL+CGA組蛋白表達量明顯較BDL+NS組低。由Bax和bcl-2表達結(jié)果可知，在各時間點，BDL+CGA組的Bax/bcl-2值均大于BDL+NS組。見圖1。

2.4 Bax、bcl-2在mRNA水平的表達

在各時相點，BDL+CGA組中bcl-2 mRNA的表達明顯低于BDL+NS組(P<0.01)，Bax mRNA的表達與BDL+NS組差異不顯著(P>0.05)。BDL+CGA組與BDL+NS組的Bax mRNA/bcl-2 mRNA有統(tǒng)計學意義，BDL+CGA組的Bax mRNA/bcl-2 mRNA比值明顯大于BDL+NS組(P<0.01)。見圖2。

圖1 14天時大鼠肝臟Bax蛋白和bcl-2蛋白的表達

圖2 14天時大鼠肝組織Bax mRNA、bcl-2 mRNA的表達

組別n7天14天21天SO組80.397±0.0230.389±0.0280.386±0.039BDL+NS組80.476±0.020a0.522±0.031a0.602±0.027aBDL+CGA組80.423±0.021bc0.442±0.019ac0.541±0.022ac

注：與SO組相比，aP<0.01，bP<0.05；與BDL+NS組相比，cP<0.01。

表6 大鼠肝臟III型膠原mRNA的表達(III型膠原mRNA/β-actin mRNA)

注：與SO組相比，aP<0.01；與BDL+NS組相比，bP<0.01。

2.5 I型、III型膠原在mRNA水平的表達

RT-PCR結(jié)果顯示，SO組大鼠肝組織I型膠原mRNA、III型膠原mRNA在7天、14天和21天的表達相對較低；BDL+NS組和BDL+CGA組的I型、III型膠原mRNA隨著時間的增長逐漸增加。與SO組比較，BDL+NS組I型、III型膠原mRNA表達水平明顯上升(P<0.01或P<0.05)；與BDL+NS組比較，BDL+CGA組I型、III型膠原表達水平明顯下降(P<0.01)，見表5～6。

3 討論

研究證實，肝臟損傷能激活枯否細胞(KC)，活化的KC會分泌GGF-β等細胞因子進一步激活肝星狀細胞(hepatic stellate cell,HSC)，HSC活化、增殖，轉(zhuǎn)變?yōu)榧〕衫w維細胞，并大量合成I型膠原、III型膠原和纖維連接蛋白等細胞外基質(zhì)(ECM)成分，導致肝纖維化的發(fā)生[6]。肝臟中合成膠原的細胞主要是間質(zhì)細胞，尤其是HSC，HSC凋亡與肝纖維的緩解有關(guān),特別是隨著肝纖維化的減輕，活化的HSC可以選擇性的凋亡[7]。因此，促進活化的HSC凋亡被認為是治療肝纖維化的有效措施[8]。細胞凋亡的發(fā)生是由基因調(diào)控的，Bax和bcl-2是一對能促進和抑制細胞凋亡的代表基因[9]。肝組織中Bax/bcl-2比值決定著HSC凋亡的調(diào)控方向，比值高時，誘導HSC凋亡；而當Bax/bcl-2的比值低時，HSC的凋亡受到抑制[10]。

本研究結(jié)果顯示CGA治療組ALT與AST水平均較模型組低，表明CGA具有較好的保護肝細胞功能、促進損傷肝細胞修復的作用。CGA治療組肝纖維化的程度較模型組明顯改善，證實CG對肝纖維化有較好的防治作用。用RT-PCR和Western blot分別從mRNA 與蛋白水平驗證了CGA治療組肝組織的Bax/bcl-2比值明顯大于模型組，表明CGA可能通過調(diào)節(jié)Bax和bcl-2基因促進HSC的凋亡。CGA在防治大鼠維化過程中抑制了Ⅰ型、Ⅲ型膠原的表達，表明CGA可以抑制纖維化肝組織膠原的產(chǎn)生與沉積減輕肝纖維化，降低肝臟損傷程度。酶學測定和形態(tài)學觀察結(jié)果提示，21天時，CGA對阻塞性黃疸大鼠肝纖維化的治療作用較7天和14天差，在治療后期CGA需與其他抗肝纖維化藥物聯(lián)合用藥。

本研究開展了CGA在抗肝纖維化方面的作用研究，并探討了其作用機制，豐富了藥物的抗肝纖維化作用，為尋找特異、有效的抗肝纖維化治療藥物奠定了基礎(chǔ)。

參考文獻

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