苦參不同制劑及成分對(duì)合軸馬拉色菌標(biāo)準(zhǔn)株體外抑菌實(shí)驗(yàn)研究

張豐川 蔡玲玲 李元文 趙雅靜 周志強(qiáng) 趙鳳珠

馬拉色菌(Malassezia)是一種存在于人類及溫血?jiǎng)游镎Ｆつw上的常見嗜脂性真菌，屬于擔(dān)子菌亞門-層菌綱-銀耳臥線黑粉菌科-馬拉色菌屬[1]。馬拉色菌感染的發(fā)病率日益增加，但目前抗菌西藥存在療效欠佳、不良反應(yīng)多、耐藥等缺點(diǎn)。從中草藥中尋找廣譜、高效、低毒的抗真菌新藥已成為藥物研究的熱點(diǎn)，研究主要集中在治療馬拉色菌相關(guān)皮膚病及中藥單體抑制馬拉色菌方面。因此本文選取了目前抑菌療效公認(rèn)的苦參作為研究對(duì)象，通過苦參不同制劑以及苦參的主要成分苦參堿、氧化苦參堿與西藥酮康唑粉進(jìn)行體外抑菌實(shí)驗(yàn)，比較抑菌作用的優(yōu)劣，尋找抑菌最佳的劑型或成分并探討中藥抑菌作用和機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 材料

苦參粉：取北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院中藥房苦參飲片100 g在醫(yī)院制劑室采用小型中藥粉碎機(jī)(廣州康諾，型號(hào)：SF-130)研磨成細(xì)粉過120目篩,過3遍。

苦參顆粒劑：由北京康仁堂生產(chǎn)。1 g相當(dāng)于飲片10 g,共取10 g。(批號(hào):國(guó)藥，按照飲片管理)

苦參堿、氧化苦參堿：由湖北午時(shí)藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)。(國(guó)藥準(zhǔn)字H20059335)

酮康唑粉：由西安楊森制藥有限公司生產(chǎn)，含量99.9%，溶于2.5%二甲基亞砜(MDSO)溶液，控制MDSO終濃度低于1%。

實(shí)驗(yàn)菌種:實(shí)驗(yàn)用合軸馬拉色菌菌株(臨床菌株：01780 CBS7222，標(biāo)準(zhǔn)菌株：01899 M.Sympodidalis)，為北京醫(yī)科大學(xué)醫(yī)院真菌實(shí)驗(yàn)室李若瑜教授惠贈(zèng)。

主要儀器:麥?zhǔn)媳葷峁堋⒏邏簻缇?SANYOMLS-3020)、水浴箱(北京市醫(yī)療設(shè)備廠)、恒溫培育箱(XMT-152C，重慶四達(dá)實(shí)驗(yàn)儀器廠)、超凈臺(tái)(造鑫企業(yè)有限公司)、顯微鏡(OLYMPUS-BX60F5)、血球計(jì)數(shù)板(上海市求精生化實(shí)劑儀器有限公司，批號(hào)02270113)、一次性玻璃實(shí)管(直徑10 mm×75 mm，愛思進(jìn)塑料臺(tái)州有限公司，批號(hào)071110)、電子天平(沈陽龍騰電子稱量?jī)x器有限公司)、雙層鐵皮電爐(上海武定電器廠，CL-A型220伏1200瓦)、8×12孔圓底酶標(biāo)板(中國(guó)北京化工廠)。

1.2 方法

通過改良美國(guó)國(guó)家臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)制訂的M27-A方案中酵母菌微量稀釋法，對(duì)合軸馬拉色菌標(biāo)準(zhǔn)株進(jìn)行體外抑菌實(shí)驗(yàn)，在同一條件下找到苦參粉組、苦參免煎顆粒組、苦參堿組、氧化苦參堿組、酮康唑組五組對(duì)合軸馬拉色菌的體外抑菌的最佳濃度。

參考其他類似實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)用馬拉色菌液體培養(yǎng)基對(duì)藥物進(jìn)行稀釋，考慮藥液濃度越高，培養(yǎng)基濃度越稀，這樣設(shè)計(jì)的缺陷是沒有考慮到培養(yǎng)基濃度對(duì)于真菌生長(zhǎng)的影響。本次實(shí)驗(yàn)中改用生理鹽水將藥液進(jìn)行稀釋，而96孔板和試管中的菌液濃度、液體培養(yǎng)基的濃度都保持一致。此設(shè)計(jì)可以排除培養(yǎng)基濃度不同給實(shí)驗(yàn)結(jié)果帶來的干擾因素。為盡量減少實(shí)驗(yàn)誤差，每種藥物的抑菌實(shí)驗(yàn)在相同實(shí)驗(yàn)條件下至少重復(fù)10次，結(jié)果取均值。

1.2.1 菌懸液制備 (1)用接種環(huán)挑合軸馬拉色菌標(biāo)準(zhǔn)菌株接種于橄欖油固體培養(yǎng)基上，37℃恒溫溫箱培養(yǎng)2天；(2)連續(xù)傳代培養(yǎng)2次；(3)用無菌生理鹽水洗脫純化的菌落，制成菌懸液；(4)用比濁儀調(diào)整其至麥?zhǔn)?號(hào)比濁管濃度；(5)用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)其菌含量，并調(diào)其濃度為(1.0～2.0)×107CFU/ml；(6)在96孔板上每孔用移液器加入菌液100 μl。

1.2.2 96孔酶標(biāo)板組藥液加樣 (1)液體培養(yǎng)基的配置:麥芽糖浸膏1.6 g、蛋白胨2.4 g、葡萄糖5 g、蒸餾水500 ml，稱取上述原料放入燒瓶中，加入蒸餾水用玻璃棒攪拌10分鐘，使其充分溶解，然后裝入試劑瓶中；高溫高壓滅菌90分鐘(103.4 kPa，121℃)；滅菌后，放入4℃冰箱儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?2)按照每孔加入100 μl后分別含藥液100%、90%、80%、70%、60%、50%、40%、30%、20%、10%的比例將苦參粉組、苦參免煎顆粒組、苦參堿組、氧化苦參堿組、酮康唑組貯備液直接用合軸馬拉色菌液體培養(yǎng)基各配置10個(gè)濃度。(3)同時(shí)設(shè)一組陰性對(duì)照：每孔加入合軸馬拉色菌液體培養(yǎng)基200 μl；一組陽性對(duì)照：每孔加入制備好的菌液100 μl及合軸馬拉色菌液體培養(yǎng)基100 μl。(4)每種藥同時(shí)做5組。(5)在搖床上將菌液及藥液混勻5分鐘。放入35 ℃恒溫箱孵育。

1.2.3 試管組藥液加樣 為了保證體外實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性，在液體培養(yǎng)基96孔板方法基礎(chǔ)上，又增加了一組液體培養(yǎng)基試管組，以互相驗(yàn)證。苦參粉組、苦參顆粒組、苦參堿組、氧化苦參堿組、酮康唑藥液濃度稀釋和制備方法同前。但考慮到試管體積較大，液體量太小不適合進(jìn)行濁度的比較，故放大液體10倍，并增加至15個(gè)濃度來進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。試管總的液體容積為6 ml，將5組中每組的10個(gè)管內(nèi)分別加入菌液1 ml、不同濃度藥液1 ml、培養(yǎng)液1 ml。第11個(gè)試管為陽性組：菌液1 ml、培養(yǎng)液1 ml、蒸餾水1 ml；第12個(gè)試管為陰性組：藥液1 ml、培養(yǎng)液1 ml、蒸餾水。加樣后在搖床上將菌液及藥液混勻5分鐘，放入35℃恒溫箱內(nèi)孵育。

1.2.4 加樣后最終的藥液濃度 96孔酶標(biāo)板組和試管組加樣后藥液濃度保持一致，具體結(jié)果如下：(1)苦參粉組10個(gè)含藥孔濃度分別是：100 mg/ml、90 mg/ml、80 mg/ml、70 mg/ml、60 mg/ml、50 mg/ml、40 mg/ml、30 mg/ml、20 mg/ml、10 mg/ml。(2)苦參顆粒劑組10個(gè)含藥孔濃度分別是：10 mg/ml、9 mg/ml、8 mg/ml、7 mg/ml、6 mg/ml、5 mg/ml、4 mg/ml、3 mg/ml、2 mg/ml、1 mg/ml。(3)酮康唑組、苦參堿組、氧化苦參堿組三組制備方法和濃度相同，10個(gè)含藥孔濃度分別為：1.0 mg/ml、0.9 mg/ml、0.8 mg/ml、0.7 mg/ml、0.6 mg/ml、0.5 mg/ml、0.4 mg/ml、0.3 mg/ml、0.2 mg/ml、0.1 mg/ml。

1.2.5 結(jié)果判讀及統(tǒng)計(jì) 48小時(shí)、72小時(shí)兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)分別觀察結(jié)果，由于馬拉色菌為嗜脂性的，菌落浮在液體表面，微黃色，薄薄一層漂浮在透明的液基表面，肉眼觀察非常清晰，采用直接法讀取數(shù)據(jù)。結(jié)果判斷的前提是陽性對(duì)照生長(zhǎng)良好，陰性對(duì)照無菌生長(zhǎng)清晰，其它孔隨藥物濃度梯度升高而菌的生長(zhǎng)受到抑制。若存在拖尾現(xiàn)象，則將每孔內(nèi)生長(zhǎng)情況與陽性對(duì)照做比較，以生長(zhǎng)被抑制80%判定為MIC值，根據(jù)菌液的清濁程度尋找最佳抑菌濃度。

2 結(jié)果

2.1 液體培養(yǎng)基96孔板結(jié)果

48小時(shí)后液體培養(yǎng)基96孔板結(jié)果示：五組里面MIC值從低到高分別是：苦參堿組<氧化苦參堿組<酮康唑組<苦參顆粒組<苦參粉水提組。苦參水提劑組：MIC為70 mg/ml；苦參顆粒組：MIC為6 mg/ml；酮康唑組：MIC為0.6 mg/ml；氧化苦參堿組：MIC為0.4 mg/ml；苦參堿組：MIC為0.3 mg/ml。在實(shí)驗(yàn)中觀察到苦參粉水提組在濃度10 mg/ml時(shí)出現(xiàn)比對(duì)照組生長(zhǎng)更快，考慮可能與操作中的污染或者苦參中某些成分也許有助于真菌生長(zhǎng)，而在某些濃度時(shí)苦參表現(xiàn)出抑菌的一面，具體的機(jī)理探討希望以后通過別的實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步探索研究。見表1。

72小時(shí)后液體培養(yǎng)基96孔板結(jié)果示：五組里面MIC值從低到高分別是：苦參堿組<氧化苦參堿組<酮康唑組<苦參顆粒組<苦參粉水提組?？鄥⑺釀┙M：MIC為80 mg/ml；苦參顆粒組：MIC為7 mg/ml；酮康唑組：MIC為0.8 mg/ml；氧化苦參堿組：MIC為0.5 mg/ml；苦參堿組：MIC為0.4 mg/ml。見表2。

從表1、表2觀察結(jié)果分析，各組作用開始下降，出現(xiàn)了耐藥的現(xiàn)象，而酮康唑組的耐藥現(xiàn)象出現(xiàn)的最早，而其它幾組雖出現(xiàn)耐藥，但耐藥情況差異不顯著，且都與酮康唑組有明顯差異。產(chǎn)生此種情況的原因很多，污染是其中最常見的一種，但是僅在酮康唑組出現(xiàn)，值得進(jìn)一步研究或通過新的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

2.2 液體培養(yǎng)基試管觀察結(jié)果

48小時(shí)得出結(jié)果見表3。

72小時(shí)得出結(jié)果見表4。

通過表3、表4可知：苦參的主要生物堿中苦參堿具有較好的體外抑制馬拉色菌作用。氧化苦參堿與酮康唑的體外抑菌作用相當(dāng)，而苦參水提劑及苦參顆粒劑體外抑菌作用較差?？鄥A是苦參中起抑菌作用的主要成分。

表1 48小時(shí)后96孔板結(jié)果

注：“+”表示與馬拉色菌的生長(zhǎng)與陽性對(duì)照組接近，“++”表示馬拉色菌比陽性對(duì)照組生長(zhǎng)更快，“-”表示能抑制陽性的80%。

表2 72小時(shí)后96孔板結(jié)果

注：“+”表示與馬拉色菌的生長(zhǎng)與陽性對(duì)照組接近，“++”表示馬拉色菌比陽性對(duì)照組生長(zhǎng)更快，“-”表示能抑制陽性的80%。

表3 48小時(shí)后試管液體培養(yǎng)基結(jié)果

注： “+”表示與馬拉色菌的生長(zhǎng)與陽性對(duì)照組接近，“-”表示能抑制陽性的80%。

(1)苦參水提劑組：MIC值為80 mg/ml,最佳抑菌濃度(mg/ml)：90>100>80>70；

(2)苦參顆粒組：MIC值為6 mg/ml,最佳抑菌濃度(mg/ml)：8>10>9>7；

(3)酮康唑組：MIC值為0.4 mg/ml，最佳抑菌濃度(mg/ml)：1>0.9>0.8>0.7；

(4)氧化苦參堿組：MIC值為0.35 mg/ml，最佳抑菌濃度(mg/ml)：1>0.9>0.8>0.7；

(5)苦參堿組：MIC值為0.3 mg/ml，最佳抑菌濃度(mg/ml)：1>0.9>0.8>0.7。

表4 72小時(shí)后試管液體培養(yǎng)基結(jié)果

注： “+”表示與馬拉色菌的生長(zhǎng)與陽性對(duì)照組接近，“++”表示馬拉色菌比陽性對(duì)照組生長(zhǎng)更快，“-”表示能抑制陽性的80%。

(1)苦參水提劑組：MIC值為90 mg/ml,最佳抑菌濃度(mg/ml)：90>100>80>70；

(2)苦參顆粒組：MIC值為6 mg/ml,最佳抑菌濃度(mg/ml)：8>10>9>7；

(3)酮康唑組：MIC值為0.8 mg/ml，最佳抑菌濃度(mg/ml)：1>0.9>0.8>0.7；

(4)氧化苦參堿組：MIC值為0.45 mg/ml，最佳抑菌濃度(mg/ml)：1>0.9>0.8>0.7；

(5)苦參堿組：MIC值為0.35 mg/ml，最佳抑菌濃度(mg/ml)：1>0.9>0.8>0.7。

3 討論

馬拉色菌相關(guān)性皮膚病(Malassezia associated skin diseases,MASD)是臨床上常見難治性疾病[2]。臨床上常見由馬拉色菌引起或加重的皮膚病有脂溢性皮炎、馬拉色菌毛囊炎、花斑癬、馬拉色菌膿皰瘡、甲真菌病、銀屑病、特應(yīng)性皮炎等，這些疾病嚴(yán)重影響患者的工作、生活及心理，給患者帶來極大地痛苦，而其中大部分和合軸馬拉色菌相關(guān)。

3.1 研究目的及意義

觀察苦參的不同制劑(粉劑、免煎劑)及苦參中主要生物堿(苦參堿、氧化苦參堿)對(duì)合軸馬拉色菌標(biāo)準(zhǔn)株的體外抑菌作用，探討中藥對(duì)合軸馬拉色菌的作用靶點(diǎn)及機(jī)制。為進(jìn)一步研究中藥抗真菌的機(jī)理打下基礎(chǔ)。

合軸馬拉色菌是引起馬拉色菌相關(guān)皮膚病的重要病因之一，研究中藥對(duì)于合軸馬拉色菌的作用，有助于更好的提高臨床療效及開發(fā)發(fā)抗真菌中藥新藥。目前對(duì)于馬拉色菌研究的中醫(yī)文獻(xiàn)主要集中在藥物臨床療效觀察及體外抑制實(shí)驗(yàn)，但對(duì)于馬拉色菌的作用機(jī)制未見探討，本研究從苦參的不同制劑及主要生物堿體外抑菌作用入手，探討苦參主要作用成分。

3.2 對(duì)研究對(duì)象——苦參的認(rèn)識(shí)

中草藥外用是治療馬拉色菌相關(guān)性皮膚病的主要方法，臨床報(bào)道較多，療效差異較大。同一種藥物在不同的報(bào)道中對(duì)不同菌株作用不同，提示不同提取方法提取的活性有效成分有所不同。高佩華[3]用自擬白鮮皮洗劑治療脂溢性皮炎639例，白鮮皮洗劑由白鮮皮50 g、皂莢30 g、透骨草30 g、苦參30 g組成。付蓉等[4]用香柏波治療頭皮脂溢性皮炎，香柏波的主要組成藥物是苦參、百部、側(cè)柏葉、香附，外用時(shí)制成香波外洗。苦參在《神農(nóng)本草經(jīng)》記載其有“主心腹結(jié)氣，癓瘕積聚，黃疸，溺有余瀝，逐水，除癰腫，補(bǔ)中，明目止淚”作用。其性味苦寒,歸心、肝、胃、大腸、膀胱經(jīng)，具有清熱，燥濕，殺蟲，療癬等功效，這與苦參抑制馬拉色菌作用密切相關(guān)。

早期研究多側(cè)重單味中草藥，后期多重視中草藥單體研究，其中一些藥物已分離出抗真菌有效成分，如青黛中的色胺酮、丁香中的丁香酚、苦參中的苦參堿等[5]。近年來，隨著對(duì)馬拉色菌的重視，中藥單體的體外抑菌研究也逐漸增多。

目前已從苦參中分離鑒定出超過百種以上化學(xué)成分，主要是多種生物堿和黃酮，其次還有揮發(fā)油、脂肪酸及游離氨基酸等成分。生物堿是苦參的主要有效成分，包括苦參堿(matrine)、氧化苦參堿(oxymatrine)、槐定堿(sophoridine)、槐果堿(sophocarpine)和槐胺堿(sophoramine)等，目前臨床上應(yīng)用最多及研究較深入的是苦參堿及氧化苦參堿。現(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)苦參生物堿具有調(diào)節(jié)血脂、抗氧化、抗病毒、抗腫瘤、抗炎、抗心律失常及增強(qiáng)免疫等功能[6]，而其對(duì)于真菌的抑制作用目前研究較少。

黃酮類化合物多數(shù)為二氫黃酮和二氫黃酮醇，少數(shù)為黃酮、異黃酮、查耳酮及其醇，其中僅有3種為苷?？鄥ⅫS酮是苦參中一類重要的化學(xué)成分,具有抗炎、抗腫瘤、抗心率失常等作用,能增強(qiáng)心肌收縮力、擴(kuò)張血管平滑肌等活性，近期的研究還表明苦參總黃酮具有顯著的抗滴蟲和抗菌等作用[7]。

揮發(fā)油成分以二十烷烴為主要成分，就結(jié)構(gòu)類型來看，以烯烴為主，其次為烷烴和醇類，尚含酸、醛、酮、酚等，再次為脂肪酸，主要為不飽和脂肪酸。

3.3 實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果分析

本研究中筆者對(duì)苦參粉劑、苦參顆粒劑兩種苦參常用的臨床用藥方式，苦參堿、氧化苦參堿兩種常見的苦參堿成分分別進(jìn)行了多次改良后NCCLS體外藥敏實(shí)驗(yàn)的液體培養(yǎng)基進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，除了觀察抑菌最常見MIC外，還探討了最佳抑菌濃度，為選擇苦參抑菌的主要有效成分、最佳抑菌濃度及進(jìn)行作用機(jī)制研究奠定了理論基礎(chǔ)和療效依據(jù)。

苦參粉劑、苦參顆粒劑、苦參堿、氧化苦參堿在體外液體培養(yǎng)基藥敏實(shí)驗(yàn)過程中均表現(xiàn)出一定的抑制馬拉色菌生長(zhǎng)的作用?？鄥⑺鍎⒖鄥㈩w粒劑比較，苦參顆粒劑的抑菌作用較強(qiáng)；苦參堿、氧化苦參堿比較，苦參堿的抑菌作用較強(qiáng)；綜合比較苦參堿的抑菌作用最強(qiáng)，與苦參粉水提劑、苦參顆粒劑、氧化苦參堿相比，苦參堿的MIC 值最小，說明其抑菌作用最強(qiáng)。

在觀察苦參水提劑組、苦參顆粒組的體外抑菌實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)不是濃度越高抑菌越好，這種現(xiàn)象可能與中藥制備提取的過程有關(guān)，也可能有一定誤差?；蛘咧兴幉闹须s質(zhì)干擾，研究尚不確定，因此不像單純的藥物作用那樣只和藥物本身濃度相關(guān)。而這也給今后的科研提供一種新的思路：(1)濃度不是越高越好，但是濃度低抑菌效果較差，因此中藥抑菌濃度需要適當(dāng)范圍；(2)進(jìn)一步探討中藥的有效成分和發(fā)揮作用的條件，來探索新的抑菌機(jī)制，為了今后臨床進(jìn)一步治療真菌性疾病找的最優(yōu)化的方案。試管液體培養(yǎng)基觀察比96孔更加清晰，而且適用于比濁管比較，得到的MIC更加可信。觀察過程中，也出現(xiàn)了耐藥現(xiàn)象，與96孔板現(xiàn)象相似，結(jié)論一致。

耐藥現(xiàn)象的出現(xiàn)提示：真菌導(dǎo)致疾病的反復(fù)不愈與它的耐藥性有密切關(guān)系因此如何改善耐藥性也是抗真菌的一大難點(diǎn)。雖然西藥酮康唑抑菌效果明顯，但是耐藥現(xiàn)象也最明顯，而苦參堿效果最佳，耐藥性最不明顯，可能為今后真菌藥物開發(fā)研制提供了新的思路，也是本實(shí)驗(yàn)的創(chuàng)新點(diǎn)之一。

3.4 本研究的不足和展望

在本實(shí)驗(yàn)中未對(duì)苦參的其他有效成分進(jìn)行研究，而且在其機(jī)制探討中也未對(duì)苦參粉、苦參免煎劑進(jìn)行研究。雖然本研究明確苦參堿、氧化苦參堿能抑制馬拉色真菌，但對(duì)其具體作用途徑仍未明確。所以下一階段研究的重點(diǎn)應(yīng)是通過實(shí)驗(yàn)研究其具體作用途徑，進(jìn)一步明確其作用機(jī)制。

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