急性暴飲性飲酒對小鼠腦損傷生物標志物的影響

趙美清 馮利東

酒精(乙醇)是一種親神經(jīng)的麻醉劑，慢性酗酒和暴飲性飲酒均可引起腦損傷，過去幾十年有關酒精導致腦損傷的研究多集中在慢性酗酒引起酒精中毒，比如酒精濫用和酒精依賴等。近年來，一次大量飲酒導致急性酒精中毒引起國內(nèi)外研究者的注意，其導致的急性腦損傷具有獨特的生物化學和中樞神經(jīng)系統(tǒng)變化。乙醇的致神經(jīng)毒性的機制被認為與氧自由基的神經(jīng)毒性以及線粒體細胞色素氧化酶的活性低下有關［1］。正常情況下，在細胞線粒體內(nèi)產(chǎn)生的氧自由基可以被超氧化物歧化酶 (SOD)滅活清除，即SOD可歧化過氧化物為氧和過氧化氫，從而保護細胞膜免受氧自由基的傷害，具有抗過氧化的作用［2］。丙二醛(MDA)是不飽和脂肪酸的過氧化物，由氧自由基降解細胞膜中不飽和脂肪酸而形成，可與蛋白形成共價化合物進而導致細胞的毒性損傷［3］。MDA的水平可以間接反映機體內(nèi)氧自由基的水平。以上兩種酶的水平或活性的高低與氧自由基導致的腦損傷相關。因此，研究在急性暴飲性飲酒小鼠腦組織中這些酶活性或水平的變化將有助于明確一次大量飲酒對中樞神經(jīng)系統(tǒng)的損傷作用。

材料與方法

1.實驗動物:昆明種小鼠，均為雄性，體重18～24g，由內(nèi)蒙古大學實驗動物中心提供，為清潔級動物。合格證書:SCXK(蒙)2002-0001。

2.實驗主要試劑:紅星二鍋頭酒 (50%乙醇)，批號2009-11-24，北京紅星股份有限公司。超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒和丙二醛(MDA)。檢測試劑盒均購自南京建成生物工程研究所，生產(chǎn)批號20110121。

3.實驗方法:分組及急性暴飲性飲酒動物模型的建立:隨機選擇20只健康昆明種雄性小鼠隨機分為兩組，一組進行酒精胃灌注［50%乙醇，12ml/kg(體重)］1次;另一組作為對照僅胃灌注相同容積的蒸餾水。然后在酒精胃灌注3小時后從小鼠尾部取血約3ml，靜置凝固后離心血清，應用青島SP-2100檢測血液中酒精含量專用氣相色譜儀進行酒精含量檢測，以確定動物模型成功確立。

4.腦組織處理及病理學檢查;24h后將兩組小鼠處死，手術取出腦組織編號，10%甲醛溶液容器中固定，將固定好的標本延其長軸切取最大縱切面置于包埋盒中，包埋盒置于LEICATP1020全自動脫水機中進行組織脫水，用BMJ-3包埋機包埋并冷凍凝固于蠟塊中，對蠟塊進行切片，用HE染色后置于載玻片進行固定，光鏡下觀察腦組織病理形態(tài)學改變。

5.腦組織勻漿的制備及生物標志物的測定:兩組小鼠處死后，迅速打開顱腔取出腦組織，在冰盤上用冷生理鹽水沖洗，除去血液，濾紙拭干，放在小燒杯中加入冷生理鹽水，然后用眼科小剪刀盡快剪碎組織，放入玻璃勻漿管，補足冷生理鹽水制成組織勻漿。組織勻漿用低溫離心機離心10min(2500r/min)，取適量上清液進行超氧化物歧化酶(SOD)活性、丙二醛(MDA)含量水平測定，具體操作方法均按南京建成生物工程研究所試劑盒說明書進行。

6.統(tǒng)計學方法:利用EXCEL數(shù)據(jù)庫軟件錄入數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差)表示。利用統(tǒng)計軟件GRAPHPAD進行統(tǒng)計分析。本研究數(shù)據(jù)資料應用非配對樣本t檢驗(unpaired t-test)比較組間差異，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1.急性暴飲性飲酒的小鼠動物模型的建立:在酒精胃灌注3h后取動脈血進行血液酒精濃度檢測，發(fā)現(xiàn)酒精胃灌注組血液中酒精水平均高于80mg%，而對照組(蒸餾水胃灌注組)血液中沒有發(fā)現(xiàn)任何酒精存在。說明急性暴飲性飲酒的小鼠動物模型成功確立。

2.兩組小鼠腦的病理學變化:在對酒精胃灌注組和蒸餾水胃灌注組小鼠大腦進行病理解剖學檢查。沒有發(fā)現(xiàn)明顯的大腦皮質(zhì)萎縮，大腦周圍空間以及腦室增大，顯微鏡下也沒有發(fā)現(xiàn)明顯的神經(jīng)元細胞的變性和壞死，神經(jīng)元細胞胞體萎縮、缺失，神經(jīng)元細胞軸突和樹突的數(shù)目減少，也沒有神經(jīng)膠質(zhì)細胞的增生、水腫和脫髓鞘等繼發(fā)性病理改變(圖1)。

3.急性暴飲性飲酒腦組織相關生物學標志物活力/水平的變化:單次大劑量胃灌注酒精后第2天，測定腦組織中SOD的活力和MDA的含量水平。結果表明，與空白對照組相比單次大量酒精胃灌注可以顯著性降低腦組織中SOD的活力(P＜0.01);顯著升高腦組織中MDA的含量水平(P＜0.01，表1)。

圖1 急性暴飲性飲酒動物模型——小鼠腦的病理學檢查(HE，×200)

表1 單次酒精灌注后小鼠腦內(nèi)相關生物標志物活力/水平的變化

討 論

本研究的實施建立在急性暴飲性飲酒小鼠動物模型的基礎上。過去幾十年國內(nèi)外的研究者發(fā)展建立了一系列的酒精中毒、酒精濫用和酒精戒斷的動物模型，因為在歐美國家暴飲性飲酒比較普遍，尤其在年青的人群中。所以暴飲性飲酒動物模型的發(fā)展比較完善。已經(jīng)發(fā)表的暴飲性飲酒動物模型大多選用嚙齒目動物，比如大白鼠或小白鼠，也有用靈長類或果蠅。暴飲性飲酒定義為在較短時間內(nèi) (一般為2h)攝入大量酒精使血液中的酒精濃度≥80mg%［4］。為了使血液中的酒精濃度達到或超過80mg%，研究者們選擇了不同的酒精投與路徑，比如經(jīng)口胃灌注、腹膜下注射等［5～8］;也選擇了不同劑量和次數(shù)的酒精投與，比如單次大量酒精胃灌注(最高劑量達到7g/kg)或反復多次酒精胃灌注 (8g/kg每天，共4 天)［5，6.8］。本研究采用小白鼠單次大量酒精胃灌注(50%乙醇，12ml/kg體重)作為急性暴飲性飲酒的動物模型，經(jīng)檢測此動物模型血液中的酒精濃度＞80mg%，說明此動物模型建立成功。筆者選用此動物模型除了其在操作上簡單易行外，單次大量酒精胃灌注更與現(xiàn)實生活中人們偶爾飲酒過量的情況相似，而大多數(shù)人認為偶爾醉酒不會對身體健康有大的影響，尤其是不會對中樞神經(jīng)系統(tǒng)造成大的影響。這正是本研究要強調(diào)的即使是一次過量飲酒也會對大腦造成損害。

酒精可以快速通過血腦屏障進入腦組織中進行氧化和非氧化代謝，因為大腦有很高的氧代謝率，其對于由酒精引起的氧化應激損傷更為敏感。此過程產(chǎn)生的活性氧(ROS)，特別是超氧陰離子和過氧化氫會啟動脂質(zhì)的過氧化和蛋白質(zhì)及DNA的氧化，進而會導致細胞的氧化性損傷［9，10］。MDA是脂質(zhì)的過氧化的穩(wěn)定產(chǎn)物，被認為能反映ROS介導的細胞膜損傷的程度［11］。內(nèi)源性抗氧化劑如SOD在預防氧化損傷中起關鍵的作用，此酶可歧化超氧陰離子成為氧和過氧化氫，是一種重要的氧自由基清除劑，間接反映機體清除氧自由基的能力。本實驗結果顯示:單次大量酒精攝入雖未造成大腦明顯的病理學變化，但能顯著降低腦組織中SOD的活性和升高MDA的含量水平，使腦組織中氧自由基生成增多、清除減少，引起腦組織內(nèi)氧自由基堆積，最終導致腦組織缺血缺氧改變，這就意味著僅僅一次大量飲酒就會誘發(fā)腦組織的氧化應激性損傷。為急性暴飲性飲酒所致腦損傷的預防和治療提供理論依據(jù)。

1 Brooks PJ.Brain atrophy and neuronal loss in alcoholism:a role for DNA damage?［J］.Neurochem Int，2000，37(5-6):403-412

2 Batinic-Haberle I，Rebou?as JS，Spasojevic I.Superoxide dismutase mimics:chemistry，pharmacology，and therapeutic potential［J］.Antioxid Redox Signal，2010，13(6):877-918

3 Farmer EE，Davoine C.Reactive electrophile species.［J］.Curr Opin Plant Biol，2007，10(4):380-386

4 Crabbe JC，Harris RA，Koob GF.Preclinical studies of alcohol binge drinking［J］.Ann NY Acad Sci，2011，1216(1):24-40

5 Carson EJ，and Pruett SB.Development and characterization of a binge drinking model in mice for evaluation of the immunological effects of ethanol［J］.Alcohol Clin Exp Res，1996，20(1):132-138

6 Bell RL，Rodd ZA，Lumeng L，et al.The alcohol-preferring P rat and animal models of excessive alcohol drinking ［J］.Addict Biol，2006，11(3-4):270-288

7 李爽，徐春陽，李東亮，等，急性乙醇中毒大鼠學習記憶行為的改變與腦組織中NO和nNOS含量的變化［J］.中國病理生理學雜志，2008，24(1):32-35

8 Zahr NM，Mayer D，Rohlfing T，et al.Brain injury and recovery following binge ethanol:evidence from in vivo magnetic resonance spectroscopy［J］.Biol Psychiatry，2010，67(9):846-854

9 Zimatkin SM，Pronko SP，Vasiliou V，et al.Enzymatic mechanisms of ethanol oxidation in the brain ［J］.Alcohol Clin Exp Res，2006，30(9):1500-1505

10 Hovatta I，Juhila J，Donner J.Oxidative stress in anxiety and comorbid disorders［J］.Neurosci Res，2010，68(4):261-275

11 Long J，Liu C，Sun L，et al.Neuronal mitochondrial toxicity of malondialdehyde:inhibitory effects on respiratory function and enzyme activities in rat brain mitochondria［J］.Neurochem Res，2009，34(4):786-794