RUNX3基因甲基化與鼻咽癌的臨床生物學行為關系

倪海峰 李 勇 黃光武 施紫光

TGF-β信號轉導通路的紊亂與多種腫瘤的發(fā)生密切相關，RUNX3為TGF-β信號轉導通路的重要組成成員，對細胞的分化、周期調(diào)控、凋亡和惡性轉化起負性調(diào)節(jié)作用，研究報道包括鼻咽癌在內(nèi)的多種腫瘤中發(fā)現(xiàn)RUNX3基因表達下調(diào)，而近年來研究發(fā)現(xiàn)啟動子高甲基化是RUNX3基因失活的重要機制，RUNX3基因甲基化與腫瘤發(fā)生關系密切，本實驗通過分析RUNX3基因啟動子甲基化與鼻咽癌臨床生物學行為關系，探討其在預測鼻咽癌臨床預后中的作用。

材料與方法

1.材料:本實驗所有組織標本來源于廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院和杭州市第一人民醫(yī)院自2006～2008年初次確診的患者，20例正常鼻咽上皮組織選用組織來源相同的鼻中隔矯正手術患者的鼻腔后上段近鼻咽部組織替代，取1例健康青年外周血淋巴細胞做陽性對照用。54例鼻咽癌標本中男性39例，女性15例;年齡20～78歲，平均年齡45.6歲。病理診斷(參照1991年WHO分型):低分化鱗癌48例;未分化癌6例。臨床TNM分期(參照1992年福州分期):TNM分期:Ⅰ期4例，Ⅱ期15例，Ⅲ期23例，Ⅳa期12例;淋巴結轉移36例;咽旁浸潤32例，顱內(nèi)轉移18例;遠處轉移0例。

2.方法:(1)DNA的提取:采用DNA提取試劑盒(大連寶生物工程有限公司產(chǎn)品)分別從鼻咽癌組織、慢性鼻咽炎癥組織、正常鼻咽上皮組織及外周血白細胞中提取DNA。(2)外周血DNA的CpG甲基化酶修飾:按甲基化酶試劑盒(NEB公司產(chǎn)品)說明書操作，具體實驗步驟參照文獻［1］。完畢后再進行下一步DNA的亞硫酸氫鹽修飾，作為甲基化的陽性對照模板。(3)DNA的亞硫酸氫鹽修飾:將鼻咽癌組織、慢性鼻咽炎癥組織、正常鼻咽上皮組織及外周血淋巴細胞中提取DNA及經(jīng)CpG甲基化酶處理的DNA分別做亞硫酸氫鹽修飾(所需試劑 Hydroquinone、低熔點瓊脂糖、礦物油、Sodium metabisulphite等為美國Sigma公司產(chǎn)品)，其詳細的實驗步驟參照文獻［2］。外周血淋巴細胞中提取DNA經(jīng)亞硫酸氫鹽修飾后用于非甲基化陽性對照模板。(4)甲基化特異性PCR:本實驗引物序列來源于http://genome.ucsc.edu/，RUNX3甲基化特異性引物上游引物序列為5'-TTACGAGGGGCGGTCGTACGCGGG-3'，下游引物為5'-AAAACGACCGACGCGAACGCCTCC-3'，擴增片段為220 bp。RUNX3非甲基化特異性引物上游序列為5'-TTATGAGGGGTGGTTGTATGTGGG-3'，下游引物為5'-AAAACAACCAACACAAACAACTCC-3'，擴增片段為220bp，引物由上海生物工程技術服務有限公司合成。甲基化特異性PCR程序:95℃預變性3min，94℃ 30s，59℃ 20s，72℃ 20s 37 個循環(huán)，最后延伸 72℃5min。非甲基化特異性PCR程序:95℃預變性3min;94℃30s，57℃ 20s，72℃ 20s，37 個循環(huán);最后延伸 72℃ 5min。2%的瓊脂糖凝膠電泳分析。正常外周血淋巴細胞DNA做非甲基化陽性對照，CpG甲基化酶修飾后正常外周血淋巴細胞DNA模板做甲基化陽性對照，水做空白對照。

3.統(tǒng)計學方法:采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件，以χ2檢驗進行統(tǒng)計學處理，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1.RUNX3基因的甲基化狀態(tài):陽性(甲基化)標本:用甲基化和非甲基化引物擴增均有特異性擴增產(chǎn)物;陰性(非甲基化)標本:僅有非甲基化引物擴增的產(chǎn)物。54例鼻咽癌組織中RUNX3甲基化頻率為59%(32/54)，而慢性鼻咽炎癥組織、正常鼻咽上皮組織均未檢測到RUNX3基因甲基化;3組對照比較有統(tǒng)計學差異(P＜0.01)(圖1)。

圖1 RUNX3基因的甲基化狀態(tài)

2.RUNX3基因甲基化與臨床生物學行為關系:RUNX3甲基化與鼻咽癌的生物學行為均無明顯相關(P＞0.05)(表1)。

討 論

越來越多研究傾向于認為鼻咽癌是一種表觀遺傳學疾病。鼻咽癌表觀遺傳學改變，尤其是甲基化改變，涉及包括細胞周期調(diào)控、DNA修復、細胞凋亡及腫瘤的浸潤轉移的全過程［3］。

RUNX3基因位于人染色體1p36.1，全長約67 kb，含有P1、P2兩個啟動子，6個外顯子和1290bp的開放閱讀框，RUNX3基因的轉錄主要由啟動子P2操縱。RUNX3是TGF-β信號通路下游的一個重要轉錄調(diào)節(jié)因子，引導TGF-β/Smad復合物從胞質轉入核內(nèi)特定靶位點，并促使TGF-β/Smad復合物和靶位點結合，共同激活靶基因轉錄，指導細胞分化、細胞周期調(diào)控、細胞凋亡和惡性轉化，參與TGF-β對上皮細胞生長負性調(diào)控，在TGF-β信號途徑中發(fā)揮關鍵作用［4］。

表1 鼻咽癌中RUNX3基因甲基化與臨床生物學行為關系

近年來研究發(fā)現(xiàn)胃癌、腺樣囊性癌、肺癌、食管癌等惡性腫瘤中存在RUNX3啟動子高甲基化，且異常甲基化是RUNX3基因失活的重要機制［4～6］。而有關鼻咽癌中RUNX3基因甲基化及轉錄調(diào)節(jié)機制研究鮮有報道。張勇等［7］檢測50例鼻咽組織發(fā)現(xiàn)1例RUNX3基因的甲基化，20例慢性鼻咽炎癥組織中未檢測到 RUNX3基因甲基化，并推測鼻咽組織中RUNX3表達下調(diào)與甲基化無關。Tan等［8］研究發(fā)現(xiàn)在19例鼻咽組織中沒有檢測到RUNX3基因甲基化。章華等［9］研究發(fā)現(xiàn)鼻咽癌組織中RUNX3蛋白表達下調(diào)，但下調(diào)機制未做研究。

然而本實驗研究結果發(fā)現(xiàn)RUNX3基因在鼻咽癌組織中啟動子甲基化頻率為59%(32/54);在慢性鼻咽炎癥組織和正常鼻咽上皮組織中均未檢測到RUNX3基因啟動子甲基化。表明RUNX3基因甲基化具有腫瘤特異性，RUNX3基因甲基化參與鼻咽癌發(fā)生發(fā)展。本實驗甲基化檢測結果與Tan及張勇等報道的檢測結果存在較大差異的原因可能與檢測樣本量、DNA亞硫酸氫鹽修飾方法以及檢測的甲基化位點不同有關。

Tan等檢測樣本量偏少，檢測的甲基化位點位于第2外顯子區(qū)，使用常規(guī)DNA亞硫酸氫鹽修飾方法，其敏感度和重復性較差，且同時檢測的其他4個基因(P16、RASSF1A、CDH1、hMLH1)甲基化頻率均明顯低于其他學者的研究結果。張勇等［7］檢測樣本量及檢測的甲基化位點(位于P2啟動子區(qū))和本實驗相同，但其使用常規(guī)DNA亞硫酸氫鹽修飾方法敏感度和重復性較差。目前使用常規(guī)的DNA亞硫酸氫鹽修飾技術操作復雜，DNA降解明顯，敏感度和重復性差，要求DNA量大，從微量組織中檢測非常困難。本實驗采用優(yōu)化的基于瓊脂糖珠包裹的微量DNA亞硫酸氫鹽修飾技術進行DNA的修飾反應，可保持DNA于亞硫酸氫鹽敏感的單鏈狀態(tài)，并且免去了DNA純化回收的步驟，大幅度減少了亞硫酸氫鹽修飾反應中DNA的降解，從而提高了敏感度，使從微量組織中檢測多基因甲基化成為可能。利用該技術已經(jīng)能檢測到少至2.5個腫瘤細胞內(nèi)的多個腫瘤相關基因的甲基化改變，具有極高的敏感度和特異性。因此本實驗檢測的甲基化的陽性率會偏高。Homma等［10］報道RUNX3基因CpG島從5'區(qū)向轉錄起始點方向各位點甲基化的陽性率逐漸降低，本研究檢測的甲基化位點位于P2啟動子區(qū)較Tan等檢測的甲基化位點位于第2外顯子區(qū)更靠近5'區(qū)，因此本實驗甲基化的陽性率會偏高。

綜上分析，本實驗樣本量大于40、采用優(yōu)化的DNA亞硫酸氫鹽修飾技術及使用位于P2啟動子區(qū)甲基化位點檢測是甲基化的陽性率高的主要原因。腫瘤相關基因的甲基化，作為一種新的腫瘤分子標記，已開始逐漸應用于腫瘤的早期診斷、鑒別診斷和判斷預后、預測復發(fā)［11～13］。對舌癌、乳腺癌等［11，12］研究報道RUNX3基因甲基化與淋巴結轉移、腫瘤高分期等不良預后密切相關，認為RUNX3基因甲基化可以作為判斷預后的預測指標。而本實驗雖然發(fā)現(xiàn)RUNX3基因甲基化更常見于有顱內(nèi)轉移、有淋巴結轉移、未分化癌、高T分期及晚期患者，但統(tǒng)計學分析均無統(tǒng)計學差異，因此RUNX3基因甲基化目前尚不能作為判斷鼻咽癌臨床預后的預測指標。

綜上所述，RUNX3基因甲基化參與鼻咽癌發(fā)生發(fā)展，但能否作為判斷鼻咽癌臨床預后的預測指標，需要擴大樣本研究進一步驗證，RUNX3基因甲基化是否是RUNX3基因表達下調(diào)的重要機制，有待進一步實驗研究證實。

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