非生物脅迫下植物體內(nèi)活性氧產(chǎn)生和抗氧化機制的研究概述

班兆軍，關(guān)軍鋒，李莉，馮建華，徐新明

（1.中華全國供銷合作總社濟南果品研究院，濟南 250014；2.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)與園藝學(xué)院，烏魯木齊 830052；3.河北省農(nóng)林科學(xué)院遺傳生理研究所，石家莊 050051；4.天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院，天津 300457）

非生物脅迫下植物體內(nèi)活性氧產(chǎn)生和抗氧化機制的研究概述

班兆軍1,2，關(guān)軍鋒3，李莉4，馮建華1，徐新明1

（1.中華全國供銷合作總社濟南果品研究院，濟南 250014；2.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)與園藝學(xué)院，烏魯木齊 830052；3.河北省農(nóng)林科學(xué)院遺傳生理研究所，石家莊 050051；4.天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院，天津 300457）

在逆境脅迫下，植物細胞產(chǎn)生并積累大量的活性氧，如果活性氧的產(chǎn)生與清除無法達到平衡，超出植物清除活性氧的能力時，將發(fā)生氧化脅迫，從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)、膜脂、DNA及其它細胞組分的嚴重損傷，對植物個體造成氧化損傷。植物體內(nèi)有效清除活性氧的保護機制分為酶類和非酶類保護機制。利用基因工程策略增加酶類和非酶類抗氧化劑在植物體內(nèi)的含量，從而獲得耐逆轉(zhuǎn)基因植物已取得一定的進展。

活性氧；非生物脅迫；酶類抗氧化；非酶類抗氧化；氧化損傷

植物細胞通過氧化還原進行物質(zhì)代謝、能量代謝和信息傳遞，執(zhí)行許多重要的生理功能。在正常情況下，氧分子處于氧化態(tài)，不很活潑，但是，在有氧代謝過程中或在逆境脅迫下，細胞內(nèi)產(chǎn)生的電子很容易使氧化態(tài)的氧轉(zhuǎn)變?yōu)檫€原態(tài)的氧，產(chǎn)生超氧陰離子（O2·–）、羥自由基（HO·）、單線態(tài)氧（1O2）和過氧化氫（H2O2）等物質(zhì)，這些物質(zhì)被統(tǒng)稱為活性氧（Reactive Oxygen Species，ROS）。植物體內(nèi)產(chǎn)生的大量ROS，能夠與脂類、DNA、RNA及蛋白質(zhì)等大分子發(fā)生反應(yīng)，對細胞產(chǎn)生毒害。植物體內(nèi)又由于存在多種清除ROS的抗氧化機制（Antioxidants，AOX），使ROS維持在較低水平。目前的研究證明，ROS除了具有毒害作用外，還作為信號分子在植物生長發(fā)育以及應(yīng)答逆境脅迫反應(yīng)中起非常重要的作用。植物體內(nèi)具有復(fù)雜的活性氧產(chǎn)生和清除機制，維持細胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)的微妙平衡（圖1），在避免過量活性氧造成的細胞傷害的同時，還能及時準確地應(yīng)答上游的脅迫和發(fā)育信號，并介導(dǎo)下游復(fù)雜的生理過程。

圖1 植物體內(nèi)抗氧化和活性氧之間的均衡性Fig. 1 Equi librium between AOX and ROS in plant

1、植物活性氧的產(chǎn)生和產(chǎn)生因素

1.1 活性氧的產(chǎn)生

活性氧是細胞新陳代謝的副產(chǎn)物之一，是外源性氧化劑或細胞內(nèi)有氧代謝過程中產(chǎn)生的具有很高生物活性的含氧化合物的總稱。活性氧之間在一定條件下可以相互轉(zhuǎn)變。超氧陰離子是一種重要的ROS，它由氧分子接受一個電子而形成。O2在水溶液中易發(fā)生歧化反應(yīng)生成H2O2，在酸性環(huán)境中高濃度O2的質(zhì)子化產(chǎn)物HO·2更易發(fā)生此反應(yīng)。與O2不同，H2O2不是自由基，而是一種更穩(wěn)定的分子。在一般情況下，生物體內(nèi)產(chǎn)生的H2O2常被過氧化氫酶和谷胱甘肽過氧化物酶清除，如果得不到及時清除，它可透過細胞膜，若膜外有Fe2+或者Cu+等金屬離子存在時可生成HO·。HO·是化學(xué)性質(zhì)最活潑的活性氧，具有很強的氧化作用，其壽命極短，可與周圍的生物分子反應(yīng)，產(chǎn)生不同反應(yīng)性的二級自由基。

植物細胞的細胞壁、質(zhì)膜、葉綠體、線粒體、過氧化物酶體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等部位都可以產(chǎn)生活性氧。其中葉綠體、線粒體和過氧化物酶體是植物細胞中ROS產(chǎn)生的主要細胞器。葉綠體光合電子傳遞系統(tǒng)是植物細胞ROS的一個重要來源。葉綠素分子吸收量子后由基態(tài)上升到一個不穩(wěn)定的、高能狀態(tài)的激發(fā)態(tài)，在從激發(fā)態(tài)向較低能量狀態(tài)的轉(zhuǎn)變過程中，可以與植物體內(nèi)的基態(tài)氧分子形成單線態(tài)氧（1O2），或通過電子轉(zhuǎn)移形成O2·–、H2O2和HO·等活性氧自由基。高光強刺激下當吸收的光能超過CO2同化作用的能力時，葉綠體也能產(chǎn)生1O2。光系統(tǒng)II中激發(fā)的三線態(tài)葉綠素分子與O2相互作用也產(chǎn)生1O2[1,2]。UV輻射或強光脅迫引起的光抑制作用也會導(dǎo)致葉綠體內(nèi)1O2和O2·–的產(chǎn)生[2,3]。在葉綠體光合電子傳遞鏈PSI的受體端有大量的自動氧化酶類存在，能夠通過米勒反應(yīng)將氧還原成超氧化物，O2·–可通過酶促反應(yīng)歧化成HO2和O2[4]。

細胞內(nèi)活性氧的另一個重要來源是線粒體。在線粒體呼吸鏈的電子傳遞過程中，大多數(shù)電子能通過呼吸鏈由色素氧化酶傳遞給O2，氧化生成H2O。但是，有l(wèi)%～2%的單電子從呼吸鏈中漏出，直接傳遞給O2生成O2·–。O2·–很快被線粒體的超氧化物歧化酶（SOD）分解為H2O2，H2O2通過Fenton反應(yīng)生成HO·。實驗證明，當體內(nèi)ATP生成過多、呼吸鏈上電子傳遞受阻時，會導(dǎo)致生成大量活性氧。加入呼吸鏈阻斷劑如魚藤酮、氰化物等，活性氧生成明顯增多，說明線粒體是產(chǎn)生活性氧的主要部位。

過氧化物酶體也是H2O2產(chǎn)生的主要細胞器，葉綠體光呼吸形成的乙醇酸轉(zhuǎn)移到過氧化物酶體后，在乙醇酸氧化酶作用下，生成乙醛酸和H2O2，另外過氧化物酶體中脂肪酸β-氧化過程中也有H2O2作為代謝副產(chǎn)物產(chǎn)生，嘌呤分解代謝途徑也產(chǎn)生多種ROS[5]。植物細胞內(nèi)在空間分布上與葉綠體和過氧化物酶體緊密相鄰的線粒體，是另一個產(chǎn)生ROS的細胞器，線粒體呼吸鏈末端氧化酶把底物的電子傳遞到氧分子形成水或H2O2，哺乳動物細胞中，線粒體是ROS的主要來源，植物由于AOX（Al ternative Oxidase，交替氧化酶）的存在，線粒體中產(chǎn)生的ROS相對很低[6]。AOX與呼吸鏈中的復(fù)合體III（Cytbc1復(fù)合體）競爭電子，阻止泛醌庫電位過度產(chǎn)生，限制線粒體中ROS的產(chǎn)生[7]。

細胞質(zhì)膜上的氧化還原酶系統(tǒng)（Plasma Membrane Redox System，PMRS） 是 產(chǎn) 生 H2O2的重要部位[8]。在哺乳動物中，NADPH氧化酶亞基gp9Iphox是催化ROS產(chǎn)生的關(guān)鍵酶[9]。植物中質(zhì)膜NADPH氧化酶也是H2O2產(chǎn)生的主要來源，但與哺乳動物不同，植物質(zhì)膜NADPH氧化酶的活性直接受Ca2+結(jié)合激活[10,11]。除了質(zhì)膜NADPH氧化酶外，在質(zhì)外體還存在一些產(chǎn)生ROS的酶類。在植物-病原菌互作過程中，質(zhì)外體的草酸氧化酶能催化草酸產(chǎn)生H2O2[12]。另外，多胺氧化酶（Polyamine oxidase，PAO）也是一種產(chǎn)生H2O2的重要酶類，在細胞質(zhì)外體接受光、生長素、損傷等多種刺激調(diào)控，參與細胞壁的分化和防御應(yīng)答過程[13,14]。

此外，細胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及某些酶類如環(huán)氧合酶、脂氧合酶、黃嘌呤/次黃嘌呤氧化酶等也可通過特定的化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生O2·–。

2、非生物脅迫下活性氧的抗氧化清除機制

植物在不期望的非生物逆境脅迫下，特別是在強光、紫外線照射、干旱、低溫、高溫、機械和重金屬脅迫下，會產(chǎn)生大量的ROS（例如1O2、O2·–、H2O2和HO·）。為了保護植物免受ROS毒害，植物細胞和細胞器（例如葉綠體、線粒體和過氧化物酶體）具有復(fù)雜的抗氧化防御機制（圖2）?？寡趸烙鶛C制包括酶類和非酶類兩大抗氧化保護系統(tǒng)。酶類保護系統(tǒng)包括超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、抗壞血酸過氧化物酶（APX）、單脫氫抗壞血酸還原酶（MDHAR）、脫氫抗壞血酸還原酶（DHAR）和谷胱甘肽還原酶（GR），非酶類保護系統(tǒng)包括谷胱甘肽（GSH）、抗壞血酸（AsA）、類胡蘿卜素（CAR）、甘露糖醇、維生素E（α-生育酚）和細胞色素f（Cyt f）。

2.1 酶類保護系統(tǒng)

2.1.1 超氧化物歧化酶（SOD，EC1.15.1.1）

SOD作為植物抗氧化系統(tǒng)的第一道防線，清除細胞中多余的超氧根陰離子。SOD是金屬酶，根據(jù)輔基部位結(jié)合的金屬離子的差異，SOD可分為Cu/Zn-SOD、Mn-SOD和Fe-SOD三種類型。研究普遍認為SOD是防止氧化脅迫的關(guān)鍵酶[15-18]。細胞中，O2·–易與H2O2反應(yīng)形成HO·，HO·的氧化作用非常強，對細胞的損傷極大。SOD能很快催化O2·–形成H2O2和O2，防止HO·的形成，大大地降低了活性氧對細胞的毒害作用。SOD主要分布于線粒體、細胞溶質(zhì)和基質(zhì)中，線粒體中主要是Mn-SOD，胞質(zhì)中主要是Cu/Zn-SOD，有的生物中還有Fe-SOD。低等植物細胞中，SOD以Mn-SOD和Fe-SOD為主，而高等植物中SOD以Cu/Zn-SOD為主。當非生物環(huán)境條件導(dǎo)致ROS形成增加時，SOD的表達增加。很多研究表明非生物脅迫下轉(zhuǎn)基因植物中不同SOD的過量表達。利用基因工程策略增加酶類和非酶類抗氧化劑在植物體內(nèi)的含量，從而獲得耐逆轉(zhuǎn)基因植物已取得一定的進展（表1）。

圖2 非生物脅迫下活性氧（ROS）產(chǎn)生和清除Fig. 2 ROS generation and scavenging under abiotic stress

2.1.2 過氧化氫酶（CAT，EC 1.11.1.6）

CAT是植物細胞中清除ROS最主要的酶之一，它催化H2O2形成H2O和O2。CAT主要存在于植物的過氧化酶體和乙醛酸循環(huán)體中。當植物大量產(chǎn)生ROS時，如植物在非生物逆境脅迫下，CAT起到了舉足輕重的作用。在過氧化物體脂肪酸β-氧化中能大量產(chǎn)生H2O2，過氧化氫酶對于清除該H2O2具有十分重要的作用。CAT已得到純化，該酶為同源四聚體，含有血紅素。它能夠直接分解活氧化一些底物，如甲醇、乙醇和甲酸等。植物中的CAT可分為三類，一類主要在清除乙醛酸循環(huán)中脂肪降解產(chǎn)生的H2O2；另一類主要在光合作用組織中存在，清除光呼吸中產(chǎn)生的H2O2；第三類存在于微管組織，參與植物木質(zhì)素的合成。在玉米和其它的植物中已克隆到了CAT基因[19]。研究發(fā)現(xiàn)，CAT是C3植物中H2O2清除的關(guān)鍵酶，而且是C3植物耐受脅迫所必需的[20]。

2.1.3 抗壞血酸過氧化物酶（APX，EC1.11.1.11）和谷胱甘肽過氧化物酶（GPX，EC 1.11.1.9）

除過氧化氫酶外，植物細胞中還有能將H2O2轉(zhuǎn)化為H2O的酶，如過氧化物酶（POD）。按供氫體不同，POD可被分為APX和GPX。APX也是清除H2O2的主要酶，具有特性各異的同工酶家族，根據(jù)其在植物細胞中的定位不同可分為：類囊體APX（tAPX）、葉綠體基質(zhì)可溶APX（sAPX）、微體膜APX（gmAPX）和細胞質(zhì)APX（cAPX）[21]。APX與CAT的不同之處在于，CAT不需要還原力，而且其酶活速率較高。但其對H2O2的親和力較低。

研究發(fā)現(xiàn)GPX在清除ROS中也起非常重要的作用，GPX減少H2O2和脂質(zhì)過氧化物，從而幫助植物細胞免受氧化刺激[22]。

2.2 非酶類保護系統(tǒng)

非酶類抗氧化劑分布于植物的不同亞細胞結(jié)構(gòu)區(qū)域中，清除不同種類的活性氧。這類物質(zhì)既可以直接同ROS反應(yīng)，將其還原，又可以作為酶的底物在ROS的清除中發(fā)揮重要作用。

2.2.1 抗壞血酸（AsA）

研究表明抗壞血酸是植物中含量最豐富的清除ROS的水溶性抗氧化劑[23]。所有的植物組織都能合成抗壞血酸，通常在光合細胞和分生組織（某些水果）中含量更高。有報道表明葉肉細胞大約有20%-40%的抗壞血酸存在于葉綠體中，其中抗壞血酸的濃度高達50mM[24]。抗壞血酸的濃度在植物組織中能夠達到毫摩爾級。抗壞血酸在植物的生長和發(fā)育中具有非常重要的作用[12]?？箟难峥梢宰鳛檫€原劑，直接與ROS反應(yīng)，清除ROS，另外，它也作為酶的底物在ROS清除中扮演重要角色；抗壞血酸也能夠在α-生育酚和玉米黃質(zhì)的再生循環(huán)中充當還原劑；抗壞血酸的第三種功能是在葉綠體類囊體表面作為還原劑參與抗壞血酸過氧化物酶介入的過氧化氫的清除，在這一過程中，抗壞血酸被氧化為單脫氫抗壞血酸。在完全氧化的脫氫抗壞血酸產(chǎn)生的情況下，還原型谷胱甘肽可以通過谷胱甘肽還原酶得到還原。由于抗壞血酸在清除活性氧的過程中發(fā)揮了重要作用，故而在葉綠體中，這一與氧的攝入、APX的功能及分子氧還原相關(guān)的過程最近被稱為“米勒-抗壞血酸過氧化物酶光呼吸”[19]。

2.2.2 谷胱甘肽（GSH）

GSH是由Glu-Cys-Gly組成的三肽，分還原型和氧化型兩種，還原型GSH是植物中最重要的抗氧化劑，它可與氧化型GSH相互轉(zhuǎn)化[19]。在植物中，GSH主要通過兩種機制起作用，一是GSH與巰基反應(yīng)，形成硫自由基（thjyl radical），與另一個氧化型的谷胱甘肽形成二硫鍵（GSSG）。二是與脫氫抗壞血酸反應(yīng)，生成抗壞血酸或使蛋白質(zhì)的二硫鍵斷裂。

GSH在植物中分布廣泛，在一些豆科植物中，GSH的含量較高。植物中GSH的水平隨生長狀態(tài)、年齡以及生長環(huán)境的不同而不同。一般說來，逆境下還原型GSH含量升高。如在光照條件中植物細胞胞質(zhì)中GSH濃度可達到1-4 mmol/L。細胞內(nèi)谷胱甘肽主要是以還原狀態(tài)存在，大豆葉綠體中其含量大約占70%，而豌豆葉綠體中含量可達90%[17]。

GSH可以通過多種方式實現(xiàn)抗氧化作用，首先還原型GSH能作為供氫體，通過與脫氫抗壞血酸還原酶反應(yīng)使抗壞血酸從氧化型轉(zhuǎn)變?yōu)檫€原型，它也可通過非酶促反應(yīng)，還原脫氫抗壞血酸；第二，還原型GSH能與單線態(tài)氧、HO·和O2·–等直接發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，清除ROS；第三，GSH還可以還原脂過氧化物使其形成脂酰過氧化物，從而達到穩(wěn)定膜的作用。

2.2.3 維生素E

研究表明，生育酚尤其是其中的α-生育酚（Ve）是植物中重要的ROS清除劑。它主要通過捕捉活性氧及脂過氧化自由基調(diào)節(jié)膜脂的狀態(tài)來穩(wěn)定膜。另外它還能夠與脂肪酸發(fā)生反應(yīng)，形成復(fù)合物[19]。生育酚也可以直接淬滅單線態(tài)氧，還能通過與過氧化自由基反應(yīng)，破壞碳自由基鏈式反應(yīng)，導(dǎo)致碳自由基擴增反應(yīng)的終止。

2.2.4 其他

在植物的光合作用過程中，類胡蘿卜素（CAR）能夠捕獲葉綠素中產(chǎn)生的活性氧，保護光合作用系統(tǒng)，避免ROS對植物的傷害。類胡蘿卜素主要通過以下機制起到抗氧化劑保護作用，一是與膜脂過氧化產(chǎn)物反應(yīng)終止過氧化反應(yīng)；二是通過與單線態(tài)氧反應(yīng)降低其毒性；三是通過與基態(tài)或激發(fā)態(tài)葉綠素分子反應(yīng)，防止單線態(tài)氧的形成；四是通過參與葉黃素循環(huán)防止過多的ROS產(chǎn)生[25]。此外，類胡蘿卜素還能夠增加生育酚捕獲過氧化自由基的能力[26]。

類黃酮是近年來研究發(fā)現(xiàn)的主要的ROS清除劑。體外研究表明類黃酮可以直接清除活性氧。但在體內(nèi)卻未必如此，因為類黃酮主要定位于液泡，而活性氧離子并不能從葉綠體擴散至液泡中，因而在植物細胞中，類黃酮只能在活性氧的產(chǎn)生部位或附近部位進行清除，如液泡或細胞壁。而H2O2卻比較穩(wěn)定而且能夠穿過生物膜，所以類黃酮在H2O2的清除中扮演極為重要的角色[27]。

脯氨酸（Proline）近年來被視為潛在的抗氧化和植物細胞程序性死亡的抑制劑。因此脯氨酸可以認為是一種動植物和微生物用來消除ROS不利影響的非酶類抗氧化劑[28]。植物中的Δ1-吡咯啉-5-羧酸合成酶（P5CS）和Δ1-吡咯啉-5-羧酸還原酶（P5CR）催化谷氨酸經(jīng)由Δ1-吡咯啉-5-羧酸（P5C）合成脯氨酸的過程[29]。游離脯氨酸被認為是一種蛋白質(zhì)穩(wěn)定劑、金屬螯合劑、脂類過氧化物的抑制劑和1O2、HO·的清除劑[30]。甘露醇也被發(fā)現(xiàn)為有效的HO·的清除劑。

3、結(jié)論和展望

總之，各種非生物脅迫導(dǎo)致ROS產(chǎn)生過剩，從而對植物體產(chǎn)生毒性最終導(dǎo)致氧化應(yīng)激。在非生物脅迫條件下，ROS或者自由基參與植物細胞中的各代謝過程，都有可能對植物細胞產(chǎn)生毒害作用。影響細胞膜的性質(zhì)和可能導(dǎo)致核酸、脂類和蛋白質(zhì)的氧化損傷，甚至影響它們的功能性。然而，植物細胞本身具有的清除自由基的抗氧化防御系統(tǒng)，這種抗氧化系統(tǒng)包括酶類（SOD、CAT、APX和GPX等）以及非酶類（抗壞血酸、谷胱甘肽、類黃酮、類胡蘿卜素和脯氨酸等）。

植物體內(nèi)提高抗氧化酶類活性及抗氧化劑物質(zhì)含量，增強抗氧化代謝循環(huán)的水平，強化植物活性氧解毒體系，現(xiàn)已證實是提高植物脅迫耐性的有效途徑。利用基因工程手段，在研究抗氧化酶類在清除活性氧方面的功能及作用中，SOD，APX，GR和CAT的大量表達提高了植株對氧化脅迫的抗性，植物對脅迫脅迫的耐性得到了不同程度的提高（表1）。

活性氧解毒系統(tǒng)是植物抗脅迫保護機制的一個主要組成部分，隨著植物適應(yīng)脅迫能力的增加，清除活性氧自由基能力也隨之增加。對大量活性氧的適應(yīng)是與植物抗氧化酶類活性增加相聯(lián)系的。然而，由于脅迫反應(yīng)中基因表達以及脅迫代謝的復(fù)雜性，許多抗氧化劑參與活性氧的清除過程，而且在氧化脅迫下，許多細胞組分需要保護，所以氧化脅迫抗性要求一個完整的、增強的抗氧化體系[31]。

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農(nóng)業(yè)科技成果轉(zhuǎn)化資金項目（2011GB24420002）

班兆軍（1980- ），男，助理研究員，研究方向為果蔬采后生理及貯運保鮮，E-mai l:banzhaojun@yahoo.cn，電話:0531-88932575

馮建華（1960- ），女，研究員，主要從事農(nóng)產(chǎn)品冷鏈物流、采后保鮮技術(shù)及保鮮材料的研究推廣工作，E-mai l: jhfeng123456@163.com