中國(guó)患者華法林抗凝治療劑量的藥物基因組學(xué)相關(guān)性及藥物基因組學(xué)方程的比較分析

王紅娟，劉 瑜，楊 潔，徐 斌，李 泱，尹 彤

（中國(guó)人民解放軍總醫(yī)院老年心血管病研究所, 北京 100853）

華法林是防治血栓栓塞性疾病最常用的口服抗凝劑，但是其臨床有效劑量存在很大的個(gè)體差異。隨著遺傳藥理學(xué)的發(fā)展，現(xiàn)已證實(shí)編碼華法林代謝和藥效相關(guān)酶的基因的遺傳多態(tài)性在很大程度上解釋了華法林的個(gè)體差異和種族差異，包括細(xì)胞色素氧化酶P450（CYP）2C9、維生素K環(huán)氧化物還原酶復(fù)合體1（VKORCl）以及CYP4F2[1-3]。以遺傳藥理為基礎(chǔ)的華法林藥物基因組學(xué)劑量預(yù)測(cè)方程得到越來(lái)越多的關(guān)注，2007年美國(guó)食品與藥品監(jiān)督管理局更新華法林的處方，推薦用藥前患者接受相關(guān)基因型檢測(cè)[4]。但是，目前為止藥物基因組學(xué)方程的驗(yàn)證全部都是在接受傳統(tǒng)強(qiáng)度抗凝治療（目標(biāo) INR為 2至 3）的患者中進(jìn)行，而大多數(shù)的中國(guó)患者常規(guī)接受低強(qiáng)度華法林治療[5]。研究顯示，除種族因素外，方程的預(yù)測(cè)效果同樣受華法林劑量影響[6]。因此，本研究在一個(gè)接受低強(qiáng)度治療的中國(guó)患者隊(duì)列中評(píng)估遺傳因素和藥物基因組學(xué)方程的預(yù)測(cè)效果與華法林劑量的相關(guān)性。

1 對(duì)象與方法

1.1 對(duì)象

中國(guó)人民解放軍總醫(yī)院自2008年1月至2011年 7月連續(xù)收治的 282例中國(guó)患者。男性 140 例（49.6%），女性 142 例（50.4%），平均年齡（56.36±15.70）歲。接受抗凝治療的主要原因分別為房顫（85例，30.1%）、瓣膜置換術(shù)后（138例，48.9%）、深靜脈血栓形成/肺栓塞（45例，16%）以及其他（14例，5%）。入選標(biāo)準(zhǔn)包括因各種原因目前正在接受穩(wěn)定劑量華法林抗凝治療，目標(biāo)INR為1.6～2.5，且初次用藥日期明確。穩(wěn)定華法林劑量定義為連續(xù)3次（每次間隔至少一周）實(shí)驗(yàn)室檢查證實(shí)INR維持目標(biāo)范圍的劑量。臨床信息收集自住院和門診病歷記錄?；颊叽嬖趪?yán)重腎臟、肝臟、血液系統(tǒng)疾病，惡性腫瘤，醫(yī)療信息不全，目標(biāo)INR在1.6～2.5之外，血壓超過(guò)180/110 mmHg，以及妊娠或哺乳期均排除。根據(jù)實(shí)際華法林使用量人群分為三個(gè)不同劑量組。包括低劑量（≤1.5 mg/d），中間劑量（≥1.5 mg/d，且≤4.5 mg/d）和高劑量（≥4.5 mg/d）。所有患者于參加研究前均需簽署知情同意書。研究方案經(jīng)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。所有患者于參加研究前均需簽署知情同意書。研究方案經(jīng)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1 基因型測(cè)定 采集外周血提取基因組DNA。多重 SNaPshot SNP分型技術(shù)檢測(cè) CYP2C9*3(rs1057910)、VKORC1-1639 G/A (rs9923231)以及CYP4F2*3 (rs2108622)基因多態(tài)性。主要儀器包括東勝?龍（EDC-810）PCR儀（北京東勝創(chuàng)新生物科技有限公司），ABI 3730自動(dòng)測(cè)序儀（美國(guó)ABI公司）。主要試劑包括Taq酶、SAP酶和ExoI酶（均為 Fermentas公司），Snapshot mix（美國(guó) ABI公司）。每個(gè)變異位點(diǎn)的上下游引物和延伸引物分別為（1）CYP2C9*3，上游引物：5￠ TCAGCTAAAGTCCAGGAAGAG 3￠，下游引物：5￠ AACATGGAGTTGCAGTGTAGG 3￠，延伸引物：5￠ TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGCACGAGGTCCAGAGATAC3￠；（2）VKORC1-1639 G＞A，上游引物：5￠GCTTGTCTTAAACTCC 3￠，下游引物：5￠TGAGAAACAGCATCTGGAGAG 3￠，延伸引物：5￠TTTTTTAGGCGTGAGCCACCGCACC3￠；（3）CYP4F2*3，上游引物：5￠ GAGACCAAGAAGGGTTGTTG 3￠，下游引物：5￠ TCTGCCTCATCAGTGTTTTCG 3￠，延伸引物：5￠TTTTTTTTTTTTTTTTACCTCAGGGTCCGGCCA CA3￠。參照序列為來(lái)自 GenBank的 CYP2C9、VKORC1和 CYP4F2基因組序列（NC_000010.8，NC_000016.9和NC_000019.9分別為）。所有參與研究的患者均簽署遺傳分析同意書。

1.2.2 文獻(xiàn)檢索和方程選擇 檢索PubMed自2004年1月至2011年9月報(bào)道華法林劑量預(yù)測(cè)方程的研究或綜述。采用的MeSH包括：“warfarin”，“genetic polymorphism”，“CYP2C9”，“VKORC1”，“CYP4F-2”，“pharmacogenetics”，“pharmacogenomics”以及“single nucleotide polymorphisms”。所選的方程必須同時(shí)包括臨床因素和遺傳因素，而后者必須涉及CYP2C9和VKORC1這兩個(gè)基因。排除建立于少于100人的隊(duì)列的方程，以及包括一些在本研究隊(duì)列中未予評(píng)估的因素（如血白細(xì)胞計(jì)數(shù)、維生素K攝入情況）和本研究中未分型的基因（或其等位基因）多態(tài)性的方程。

1.2.3 預(yù)測(cè)效果評(píng)估 預(yù)測(cè)效果評(píng)估指標(biāo)包括平均絕對(duì)誤差（MAE）和計(jì)算預(yù)測(cè)劑量在實(shí)際穩(wěn)定劑量20%范圍內(nèi)的患者比例（20%界限內(nèi)的比例）。MAE定義為方程計(jì)算值與實(shí)際值間絕對(duì)差異的均數(shù)。而后者為其他研究中使用過(guò)的具有臨床意義的范圍[6]。分別采用各方程計(jì)算每位患者的預(yù)測(cè)劑量。如果方程包含一個(gè)非-1639G/A的 VKORC1多態(tài)性，但是與-1639G/A呈強(qiáng)連鎖不平衡，則使用-1639G/A。鑒于CYP2C9變異（如CYP2C9*2或*11）在亞洲人群中不存在或非常罕見，在相關(guān)方程中均定義為CYP2C9*1。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

定量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，定性資料用百分率表示。采用卡方檢驗(yàn)評(píng)估每個(gè)基因的Hardy-Weinberg平衡偏離度。平均治療劑量與基因型的關(guān)系采用單向ANOVA檢測(cè)評(píng)估。統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS 19.0 軟件。

2 結(jié) 果

2.1 基因型分析

全部隊(duì)列患者中 CYP2C9*3基因*1/*1型 251例（89%），*1/*3型29例（10.3%），*3/*3型2例（0.7%）；VKORC1-1639基因AA型239例（84.8%），AG 型 40例（14.1%），GG型 3例（1.1%）；CYP4F2*3基因CC型為156例（55.3% ），CT型109例（38.7%），TT型17例（6.0%）。

2.2 基因組與華法林劑量的相關(guān)性

全部隊(duì)列的實(shí)際華法林劑量為（3.00±1.09）mg/d。各基因的多態(tài)性均達(dá)到 Hardy-Weinberg平衡（P＞0.05），樣本具有群體代表性。華法林劑量在各基因的變異基因型中均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的差異（CYP2C9*3：P＜0.001；VKORC1-1639 A/G：P＜0.001；CYP4F2*3：P＝0.025；圖 1）。

2.3 不同劑量患者中藥物基因組學(xué)方程的預(yù)測(cè)效果

選取了8個(gè)符合條件的藥物基因組學(xué)方程（表1）。各方程對(duì)不同劑量范圍患者的預(yù)測(cè)效果存在差異（表 2）。來(lái)自白種人群和混合人群的方程在高劑量（≥4.5 mg/d）人群中預(yù)測(cè)效果更好（20%界限內(nèi)的比例：46.4%～57.1%)。而來(lái)自亞洲人群的方程則在中間劑量（1.5～4.5mg/d）患者中預(yù)測(cè)效果更好。入選的方程在低劑量患者中預(yù)測(cè)效果均不佳，20%界限內(nèi)的比例均低于10.0%。

3 討 論

本研究在一個(gè)282例接受低強(qiáng)度穩(wěn)定劑量華法林抗凝治療的中國(guó)患者隊(duì)列中，證實(shí) CYP2C9*3、VKORC1-1639 A/G和CYP4F2*3基因的多態(tài)性均與華法林劑量相關(guān)，已發(fā)表的藥物基因組學(xué)方程對(duì)華法林劑量預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確性因患者實(shí)際華法林劑量不同而存在差異。來(lái)自白種人群和混合人群的方程對(duì)高劑量（≥4.5mg/d）患者的預(yù)測(cè)效果更好，而目前尚無(wú)方程可以很好的預(yù)測(cè)低劑量（≤1.5mg/d）患者的劑量。

本研究與既往在中國(guó)患者中進(jìn)行的研究一致，均證實(shí) CYP2C9 和 VKORC1基因多態(tài)性與華法林劑量相關(guān)。其中華法林劑量在CYP2C9 1*/1*個(gè)體中最高、而3*/3*最低，而華法林維持劑量在VKORC1基因 GG型最高、而AA型最低。白種人群的研究顯示，VKORCl的多態(tài)性可以解釋華法林用藥劑量三分之一的遺傳因素影響，聯(lián)合CYP2C9可以用來(lái)解釋半數(shù)患者之間的個(gè)體差異[5]。但與白種人群相比，亞洲人群中VKORC1和CYP2C9對(duì)華法林劑量差異的貢獻(xiàn)相對(duì)較小。CYP4F2*3（rs2108622）為華法林劑量的第三個(gè)預(yù)測(cè)基因，相關(guān)研究較少。本研究證實(shí)其多態(tài)性與華法林劑量也顯著相關(guān)。既往一項(xiàng)中國(guó)患者隊(duì)列的研究顯示其可解釋 4%的穩(wěn)定華法林劑量差異[13]。由于亞洲人群中華法林劑量的差異很大程度上取決于人口次要等位基因上相關(guān)多態(tài)性的發(fā)生率，在這種情況下，CYP4F2*3對(duì)亞洲患者華法林劑量的影響盡管較小，仍不應(yīng)被忽視。

圖1 CYP2C9*3, VKORC1-1639 A/G和CYP4F2*3與華法林治療劑量的關(guān)系Figure 1 Correlationship of CYP2C9*3, VKORC1-1639 A/G and CYP4F2*3 with warfarin dose

表1 入選進(jìn)行效果評(píng)估的方程Table 1 Pharmacogenetic algorithms selected for predictive accuracy evaluation

表2 藥物基因組學(xué)方程對(duì)不同劑量患者的預(yù)測(cè)效果Table 2 Performance of pharmacogenetic algorithms in patients receiving different doss of warfarin

除種族因素外，華法林劑量也影響藥物基因組學(xué)方程的預(yù)測(cè)效果。有報(bào)道藥物基因組學(xué)方程在接受低劑量（≤3mg/d）或高劑量（≥7mg/d）患者中預(yù)測(cè)效果最好[19]。本研究中來(lái)自白種人群和混合人群的方程在高劑量（≥4.5mg/d）患者中預(yù)測(cè)效果更好（達(dá)20%界限的患者比例：46.4%～57.1%）?？紤]白種人群中的平均劑量（5mg/d）高于亞洲人群（3mg/d）[4]，因此，來(lái)源于白種或混合人群的方程在高劑量人群中的預(yù)測(cè)效果優(yōu)于來(lái)源于亞洲人群的方程也是合理的。在我們的研究中，來(lái)源于最廣泛種族人群的國(guó)際華法林藥物遺傳學(xué)協(xié)會(huì)（IWPC）方程在中劑量（≤3mg/d）患者中達(dá)20%界限的患者比例為29.0%，而在≤2mg/d患者中為8.2% 。該結(jié)果與IWPC方程在其確認(rèn)隊(duì)列中的效果相當(dāng)，≤3 mg/d的患者中為33.0%，2mg/d的患者中為15.4%[6]。數(shù)據(jù)顯示藥物基因組學(xué)方程對(duì)接受低劑量治療的患者的預(yù)測(cè)準(zhǔn)確性有限，可能為如下原因。首先，大多數(shù)已發(fā)表的藥物基因組學(xué)方程均來(lái)源于目標(biāo)INR為2～3的人群，因此這些方程無(wú)法對(duì)上述INR范圍外的劑量給予清晰地預(yù)測(cè)[2,6,9-12]。其次，可能存在其他的遺傳或非遺傳因素以解釋亞洲人群適合低劑量華法林治療[14]。這也可能是本研究中即使是來(lái)自亞洲人群的方程，對(duì)低劑量組的預(yù)測(cè)效果也仍然不佳的原因。

我們的研究提示，目前沒(méi)有一個(gè)符合條件的方程在采用低強(qiáng)度抗凝治療的患者中于全部劑量范圍表現(xiàn)最好的預(yù)測(cè)效果。因此，如何提高藥物基因組學(xué)方程在低劑量患者中的預(yù)測(cè)效果，仍需進(jìn)一步研究。

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