俄羅斯鱘雌核發(fā)育誘導及其后代的微衛(wèi)星分析*

姜彥超，蘇建通，董 穎，胡紅霞

(1．大連海洋大學，遼寧 大連 116023;2．北京市水產科學研究所，北京 100086)

鱘形目Acipenseriformes是一種很古老的軟骨硬鱗魚類，在魚類乃至整個脊椎動物進化史上占有著很重要的地位，素有“活化石”之稱[1]。世界上現(xiàn)存的鱘形目魚類約27種，其中絕大部分為河海洄游性魚類[2]。鱘魚因其魚籽醬的高價值而成為一種重要的世界性經濟魚類,由于過度捕撈、鱘魚產卵場所和棲息地的破壞以及環(huán)境污染等原因的影響，導致世界鱘魚資源總量急劇下降，許多種類瀕臨滅絕[3]。因此采用人工養(yǎng)殖和繁殖鱘魚的方法，可以大大減輕對野生資源依賴的壓力，非常有利于資源的恢復。隨著鱘魚養(yǎng)殖業(yè)的迅速發(fā)展，生產目標已經由鱘魚產量向鱘魚最有價值的產品——魚籽醬方向轉化，因此，生產和培育全雌化的苗種就成為鱘魚產業(yè)化發(fā)展的研究重點,全雌鱘魚的養(yǎng)殖也具有很高的經濟價值。

人工誘導魚類雌核發(fā)育就是用遺傳失活的精子激活卵子后，再通過抑制受精卵的極體排出或第一次卵裂而發(fā)育成子代的一種特殊的有性生殖方式。雌核發(fā)育技術已被成功應用于青鳉[4]、斑馬魚[5]、牙鲆[6]、鯉魚[7]等魚類的遺傳育種研究中。但是傳統(tǒng)的魚類雌核發(fā)育子代純合度都依賴于表型、染色體技術等去鑒定。盡管所得雌核發(fā)育子代可證明是由雌核發(fā)育所獲得，但無法確定所獲雌核發(fā)育子代是否存在基因重組現(xiàn)象，也無法證明其在基因座位 (特別是與經濟性狀相關的基因座位) 上表現(xiàn)為純合子還是雜合子。因此還應利用微衛(wèi)星等分子標記對其進行進一步分析。

微衛(wèi)星 (Microsatellites) ,又稱簡單序列重復(Simple sequence repeats,SSRs) 、 短串聯(lián)重復 (Short tandem repeats,STRs) 、 簡單序列長度多態(tài)性(Simple sequence length polymorphism,SSLP) ,是指以少數(shù)幾個核苷酸(一般為 1～6 個)為重復單位組成簡單的串聯(lián)重復序列 ,由于重復的次數(shù)不同以及重復的程度不一致而造成這些序列的多態(tài)性[8]。1992年Goff等[9]首次從斑馬魚基因組中篩選出微衛(wèi)星標記序列，此后微衛(wèi)星標記便成為生物標記領域中極為重要的一員。目前已經在斑馬魚Daniorerio[10]、尼羅羅非魚Oreochromisnilotica[11]、鮭科魚類(大西洋鮭Salmosalar，紅點斑Salvelinusalpinus，虹鱒Oncorhynchusmykiss)[12,13 14 ]以及鱘形目魚類(密西西比鏟鱘Scaphirhynchusplatorynchus，高首鱘Acipensertransmontanus和太平洋鱘A.medirostris)[17-18 ]等多種魚類中獲得了微衛(wèi)星標記序列。因微衛(wèi)星標記可提供高多態(tài)性高分辨率的遺傳信息[21-22 ]，且通用性好、呈孟德爾方式遺傳、屬于共顯性的標記，具有明顯優(yōu)于其他分子標記的優(yōu)勢[23]，所以已被廣泛應用于魚類遺傳育種研究的各個方面，包括種群遺傳結構分析、親子鑒定與個體識別、遺傳作圖等，取得了較大的進展。

本研究以冷休克和熱休克法誘導俄羅斯鱘雌核發(fā)育，在對其后代進行形態(tài)學鑒定的基礎上，進一步利用微衛(wèi)星標記區(qū)分其中的雌核發(fā)育后代、單倍體后代和雜交后代,并計算出雌核發(fā)育后代的重組率，證明了微衛(wèi)星DNA分子標記是可以用來進行雌核發(fā)育后代分析的，特別是在常規(guī)方法難以分辨的單倍體后代鑒別以及雌核發(fā)育后代重組率計算方面具有突出的優(yōu)點。為探討和完善俄羅斯鱘人工雌核發(fā)育的誘導方法和分子鑒定方法的研究，更好地利用雌核發(fā)育技術于俄羅斯鱘育種提供理論指導。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

俄羅斯鱘雌核發(fā)育誘導實驗于2010年5月在北京鱘魚良種場(北京十渡名優(yōu)魚類繁育基地)進行，采用30 cm(20 cm(30 cm的玻璃鋼桶進行孵化和魚苗飼養(yǎng)。

1.2 雌核發(fā)育誘導

1.2.1 親本選擇 從北京鱘魚良種場養(yǎng)殖的繁殖種群中選取體質健壯且性成熟的雄性達氏鰉Husodauricus和雌性俄羅斯鱘Acipensergueldenstaedtii各一尾分別作為父母本，進行催產，分別獲得相應的精子和成熟的卵。

1.2.2 精子的處理 將收集的精液放在顯微鏡下觀察精子活力，選取活力良好的精液放于4℃待用。取少量精液，用Hank’s液(氯化鈉8 g，氯化鉀400 mg，碳酸氫鈉350 mg，七水磷酸氫二鈉90 mg，十二水磷酸氫二鈉100 mg，無水磷酸二氫鉀60 mg，葡萄糖1 g，七水硫酸鎂100 mg，六水氯化鎂100 mg，氯化鈣140 mg，蒸餾水加至1 000 mL，用5.6％碳酸氫鉀調pH至7.5)按5∶19的比例進行稀釋后置于玻璃培養(yǎng)皿中，將培養(yǎng)皿放在紫外線照射裝置的水平搖床上，搖床振動頻率為60次/min，輕輕振蕩以使精子均勻分散。用紫外燈照射精液，從2 min 30 s開始鏡檢觀察精子活力，直到約80％精子停止活動，確定照射時間，收集滅活精液待用做人工授精。

1.2.3 受精卵的獲得和處理 使用滅活的精液與成熟的卵進行干法授精，待受精3 min后用滑石粉脫粘，將脫粘后的受精卵平鋪于玻璃培養(yǎng)皿上，分別進行冷休克或熱休克處理后，放入孵化器中使用17 ℃左右的池水進行孵化。

1.2.4 雌核發(fā)育誘導 冷休克誘導：在人工授精10 min后立即將受精卵放置于4 ℃冰箱中，進行40 min冷休克誘導，然后放回17 ℃水中繼續(xù)進行孵化，編號為M1。熱休克誘導：在人工授精18 min后立即將受精卵放入37 ℃水中，進行熱休克處理2 min，然后放回17 ℃水中繼續(xù)進行孵化，編號為M2。對照組人工授精：將余下的少部分卵與未經紫外線照射的精液混合，正常受精后移入到17 ℃池水中孵化，編號為G1。

1.3 微衛(wèi)星分析

1.3.1 取樣 催產成功后分別剪取各親魚鰭條保存于φ=95％的乙醇中。子代樣本于孵化后第2天開始從各組中進行采樣，冷休克組收集個體20尾、熱休克組收集40尾、對照組收集20尾，分別保存于φ=95％的乙醇中，帶回實驗室。

1.3.2 基因組DNA的提取 剪取保存在乙醇中的親魚鰭條及其后代魚苗肌肉組織大約0.2 g，分別加入400 μL裂解液，55 ℃消化過夜，待組織完全消化后取出，用酚(氯仿(異戊醇(體積比為25∶24∶1)法提取DNA。為了確保DNA樣品的質量，對提取的DNA樣品進行瓊脂糖凝膠電泳檢測和紫外分光光度計A260測定。將DNA質量濃度調至20 ng(μL,并保存于-20 ℃冰箱中備用。

1.3.3 PCR反應 本實驗中使用的微衛(wèi)星引物來自董穎等(未發(fā)表數(shù)據(jù))開發(fā)的5種鱘魚跨種擴增熒光微衛(wèi)星引物。PCR擴增反應總體積為10 μL，其中包括DNA模板0.5 μL(20 ng(μL)，10(PCR buffer 1 μL,25 mmol/L MgCl20.25 μL,2.5 mmol/L dNTP 0.8 μL，5 mmol/L正反向熒光引物各0.3 μL，5 U/μL Taq酶(TAKARA)0.05 μL，雙蒸水7.05 μL。PCR反應程序：94 ℃預變性3 min；94 ℃變性30 s,50～61 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,41個循環(huán)；72 ℃充分延伸10 min。微衛(wèi)星引物序列及具體退火溫度情況見表1。擴增產物用w=1.0％的瓊脂糖凝膠電泳進行分離，GelRed染色后用BIORAD凝膠成成像儀進行定性分析。

表1 微衛(wèi)星引物序列及特異退火溫度

1.3.4 基因型分析 使用ABI PRISM 3100 型遺傳分析儀(applied biosystems) 對擴增片斷進行測定,并用GeneMapper3.0 軟件(applied biosystems) 對基因型進行判讀。

1.3.5 數(shù)據(jù)分析 根據(jù)所得到的基因型數(shù)據(jù)，利用SPAGeDi軟件[24]計算微衛(wèi)星基因座的等位基因數(shù)、(Number of alleles，A)、等位基因頻率(Allele Frequency，P)、期望雜合度(Expected Heterozygosity，He)。并分別根據(jù)父本基因型和母本基因型分辨子代中的雜交后代、單倍體后代和雌核發(fā)育后代。

2 結 果

2.1 精子的最佳照射時間

對照組卵(俄羅斯鱘與達氏鰉雜交)的受精率與孵化率分別為95.3％和76.5％，說明俄羅斯鱘卵質量良好。用Hank’s液稀釋精液(19∶5)并放在紫外燈下照射，采用鏡檢的方法觀察精子的活動狀態(tài)，照射2 min 30 s時發(fā)現(xiàn)絕大部分精子仍在活動；照射3 min時發(fā)現(xiàn)約20％精子仍在活動，但其余大部分精子不活動；照射3 min 30 s時發(fā)現(xiàn)幾乎所有的精子都已經停止活動了。因此認為3 min的紫外線照射為最佳的照射時間，此時的精子絕大部分處于遺傳失活的狀態(tài)。

2.2 雌核發(fā)育誘導結果

將成活的魚苗飼養(yǎng)至可以清楚觀察其外形特征時，通過形態(tài)學分析發(fā)現(xiàn)在冷休克組和熱休克組中都即存在外形符合俄羅斯鱘(達氏鰉雜交后代特征的雜交鱘，也存在與純種俄羅斯鱘特征相吻合的雌核發(fā)育誘導后代[25]。

2.3 微衛(wèi)星檢測結果

選用6對具有高多態(tài)性的微衛(wèi)星標記，分別對父母本親魚及其經過雌核發(fā)育誘導產生的后代(冷休克組20尾，熱休克組40尾)進行擴增，結果6對引物均可擴增出清晰的條帶，擴增片段大小在116～414 bp。

2.4 遺傳變異分析

遺傳雜合度(H)又稱基因多樣度，是指所檢測到的微衛(wèi)星位點上雜合子基因型占該位點所有基因型的比例。從表2的結果可以看出，所檢測的等位基因座位有4～9個等位基因，各基因座位的等位基因頻率由0.006～0.774不等；其中熱休克雌核發(fā)育組的等位基因頻率為0.006～0.774，期望雜合度的平均值為0.6873，平均多態(tài)信息含量為0.610 7，平均等位基因數(shù)5.5；冷休克雌核發(fā)育組的等位基因頻率為0.001～0.708，期望雜合度平均值為0.590 6，平均多態(tài)信息含量為0.6754，平均等位基因數(shù)為6.0。Boestein等[26]認為當PIC>0.5時該位點表現(xiàn)為高度多態(tài)，當0.25

表2 俄羅斯鱘2個雌核發(fā)育群體6個座點的等位基因數(shù)、雜合度和多態(tài)信息含量

從圖1中可以看出，在微衛(wèi)星位點Afu54，母本(a)存在4個不同大小的等位基因，父本(b)為純合體，只存在1個等位基因。以父本b的基因型為診斷標記，對所檢測的樣品進行鑒定，只要在樣品中出現(xiàn)了父本b的基因型則認為該樣本是雜交個體，由此可認定樣本c為雜交后代。通過與父母本基因型的比對，可以區(qū)分樣本d為單倍體后代，而樣本e為雌核發(fā)育后代。

圖1 父母本及熱休克雌核發(fā)育組部分個體在位點Afu54的基因型

綜合運用6對微衛(wèi)星多態(tài)性標記數(shù)據(jù)，以父本特異條帶作為診斷標記，對兩組雌核發(fā)育后代進行鑒定，結果發(fā)現(xiàn)熱休克雌核發(fā)育組在6個微衛(wèi)星座位上，檢測出11個樣本含有父本基因型，因此可認定此11個樣品是由雜交發(fā)育而來的(此結果與表型判斷結果相吻合)，雜交后代占整個熱休克雌核發(fā)育組的27.5％。另外9個樣品的基因型與母本的完全相同，認為這9個樣本是由雌核發(fā)育而來的，是完全的雌核發(fā)育后代，占熱休克雌核發(fā)育組的22.5％。還有6個樣本的基因型數(shù)目在所有位點均為母本基因型數(shù)目的一半，且不含父本基因型，因此認為其為單倍體后代，占雌核發(fā)育組的15.0％。剩下的14個樣本所檢測的基因型出現(xiàn)了不同程度的重組現(xiàn)象，占整個雌核發(fā)育組的35.0％。

冷休克雌核發(fā)育組出現(xiàn)了8個樣本含有父本的基因型，雜交后代占冷休克雌核發(fā)育組的40.0％。2個單倍體樣本占雌核發(fā)育系的10.0％，未發(fā)現(xiàn)完全的雌核發(fā)育后代，出現(xiàn)了50.0％的重組基因型后代。

3 討 論

本研究中采用與俄羅斯鱘不同屬的達氏鰉作為父本,用來提供精子誘導進行俄羅斯鱘雌核發(fā)育,是因為可以從外形上很明確地區(qū)分俄羅斯鱘、達氏鰉及其雜交后代,達氏鰉口裂大，可達頭側，呈半月形，且左右鰓膜相互連接；俄羅斯鱘口裂小，且鰓膜與頰部相連；而二者雜交后代的口裂大小則介于這兩者之間(比達氏鰉口裂小，比俄羅斯鱘口裂大)，且鰓膜與頰部僅有較小部分相連。而雌核發(fā)育后代則具有和其母本相同的外形特征，因此可以通過外形鑒定區(qū)分出雜交后代。但是僅通過外形觀察尚不能區(qū)分雌核發(fā)育后代和單倍體后代，因此雖然大部分單倍體后代表現(xiàn)出脊柱側彎等單倍體綜合癥特征而不能存活，但仍不能確定所有存活下來的后代中是否有單倍體后代。Fopp-Bayat[27]使用微衛(wèi)星DNA分子標記成功辨別出西伯利亞鱘雌核發(fā)育誘導后產生的單倍體后代，本研究中也利用微衛(wèi)星標記來區(qū)分單倍體和雌核發(fā)育后代，并取得了成功。但目前使用微衛(wèi)星標記分辨單倍體尚具有一定的局限性，必須要先開發(fā)出多對具有一定多態(tài)性的微衛(wèi)星標記，再從中選擇一對在雙親中基因型不同的用來進行分析，因此此種方法不適用于多對親本混合使用的情況。另外，對于多倍體的鱘魚，為確保結果的準確性，最好使用多對微衛(wèi)星位點綜合分析。

本次實驗使用的6對微衛(wèi)星引物在兩組雌核發(fā)育系中均能擴增出相應的目的條帶，未出現(xiàn)無效等位基因現(xiàn)象。兩組雌核發(fā)育中，所有位點都表現(xiàn)出一定的雜合性。在人工誘導魚類雌核發(fā)育過程中，有時會因精子的遺傳物質沒有完全的失活，而使部分父本的雄性基因參與了遺傳，因此有必要對雌核發(fā)育后代的真實性進行確認。張海發(fā)等[28]對彭澤鯽雌核發(fā)育進行了分析，發(fā)現(xiàn)雌核發(fā)育子代中具有與父本相同而與母本相異的特異條帶。相似率為21.05％；鄒桂偉等[29]比較發(fā)現(xiàn)雌核發(fā)育鰱含有少數(shù)與父本相同的特異DNA擴增條帶，表明雌核發(fā)育鰱整入了父本雄鯉的遺傳物質。本研究用6對微衛(wèi)星引物對2組俄羅斯鱘的雌核發(fā)育后代進行分析，結果在M1和M2兩組雌核發(fā)育系中分別檢測出8尾和11尾含有父本達氏鰉中存在而母本俄羅斯鱘中并沒有的父本特異DNA擴增條帶，說明此樣本為雜交個體，雜交率分別為40.0％和27.5％。實驗中檢測到雜交個體較多，是因為這兩種魚雜交后代可活，并且具有雜交優(yōu)勢，生存能力更強。本實驗選擇紫外照射后仍有20％左右活動鏡子進行雌核發(fā)育誘導，可以通過增加滅活精子比例來降低雜交后代比例。

在兩組雌核發(fā)育系中分別得到了不同程度的單倍體個體，分別占雌核發(fā)育組的10.0％和15.0％，由于本次實驗采樣是在仔魚孵化后第2天開始的，起初所采集的樣品有一部分脊椎彎曲、肢節(jié)模糊，為單倍體綜合癥的表現(xiàn)，與實驗所得數(shù)據(jù)分析的結果相一致。在孵化階段雖有少數(shù)單倍體個體存活，但活力較差，最終全部死亡。本實驗雌核發(fā)育后代中單倍體個體存活時間相對較長，從初孵仔魚到存活3～4 d，可能與本實驗所選的材料母本俄羅斯鱘(n=8)是多倍性有關．本實驗得到的單倍體比例明顯少于鄒遠超等[30]在匙吻鱘雌核發(fā)育后代中單倍體的比例(33.5％以上)，可能因為取樣檢測時期不同，他們在原腸胚期取樣檢測，而本實驗取的是孵出仔魚，有很多單倍體不能孵化成仔魚，在胚胎時期就死亡了。

在對異質雌核發(fā)育后代共顯性分子標記檢測中一般會存在一些雜合位點，一般認為這是因卵母細胞經減數(shù)分裂時同源染色體之間發(fā)生交換引起的[33-34]，有關魚類的雌核發(fā)育群體基因重組的報道中，基因重組率的變動范圍比較大。如王偉等采用篩選獲得的10對高多態(tài)性的微衛(wèi)星引物對牙鲆異精雌核發(fā)育進行了分析，其中7個基因座位上均發(fā)生了基因—著絲粒之間的重組，重組率在42.6％～100％之間；王曉清等[36]運用6對微衛(wèi)星引物對2組大黃魚雌核發(fā)育家系進行了微衛(wèi)星標記分析，發(fā)現(xiàn)在G1代有3個微衛(wèi)星位點上發(fā)生了基因重組，重組率為12.5％，G2代有10個座位發(fā)生了重組，重組率為41.7％；Francescon等[37]發(fā)現(xiàn)歐洲鱸在6個微衛(wèi)星座位上發(fā)生了基因重組，重組率為40％～94％；Nagy等[38]發(fā)現(xiàn)鯉在9個基因座位上發(fā)生了重組，重組率為35％。本次研究的兩組俄羅斯鱘雌核發(fā)育后代在6對微衛(wèi)星引物中分別檢測出不同程度的重組現(xiàn)象，重組率分別為50％和35％。重組現(xiàn)象出現(xiàn)可能是所選擇的位點距著絲點較遠，也可能是與實驗材料的多倍性有關，當然，要獲得準確的結論還需要反復的實驗來驗證。

本實驗所獲得的兩組雌核發(fā)育系；熱休克組中得到了22.5％的完全雌核發(fā)育個體，而冷休克中并無完全雌核發(fā)育個體，由此可見采用熱休克誘導俄羅斯鱘雌核發(fā)育較冷休克相比具有明顯的優(yōu)勢，是一個行之有效的方法。

目前有關于鱘魚雌核發(fā)育的報道中只有西伯利亞鱘AcipenserbaeriBrandt[39]、短吻鱘A.brevirostrum[40]和雜交鱘Bester(H.husofemale×A.ruthenusmale)[41]的性別決定機制為雌性異型配子。通過雌核發(fā)育可產生3種基因型后代雌魚為(ZW或WW型)，雄魚為(ZZ型),因雌魚(WW型)為超雌鱘魚，所以將其與雄性鱘魚(ZZ型)交配可獲得全雌鱘魚。而匙吻鱘的雌核發(fā)育后代全部為雌性，說明其為同型雌性配子。至于俄羅斯鱘的性別決定機制尚未知曉。本實驗得到的完全雌核發(fā)育個體的性別還需要至少2 a的飼養(yǎng)才能進行鑒定。總之利用雌核發(fā)育的手段來提高俄羅斯鱘品種的遺傳純度，減少個體之間的遺傳變異以及全雌育種具有重要的意義。

參考文獻：

[1]GARDMER B G.Sturgeons as living fossils [M].New York: Springer Verlag Press,1984: 148-152.

[2]BE,MIS W E,KYNARD B.Sturgeon rivers: an introduct ion to acipenseriform biogeography and life history [J].Environmental Biology of Fishes,1997,48: 167-183.

[3]PIKITCH E K,DOUKAKIS P,LAUCK L,et al.Status,trends and management of sturgeon and paddlefish fisheries [J].Fish and Fisheries,2005,6: 233-265.

[4]IJIRI K.Gamma-ray irradiation of the sperm of the fishOryziaslatipesand induction of gynogenesis [J].Journal of Radiation Research,1980,21: 263-270.

[5]PELEGRI F,SCHULTE-MERKER S.A gynogenesis-based screen for maternal-effect genes in the zebrafish,Daniorerio[J].Methods in Cell Biology,1998,60: 1-20.

[6]YAMAMOTO E.Studies on sex-manipulation and production of cloned populations in hirame,Paralichthysolivaceus(Temminck et Schlegel)[J].Aquaculture,1999,173: 235-246.

[7]劉明華,白慶利,沈俊寶.德國鏡鯉選育及生產應用研究[J].黑龍江水產,1995,61(3): 4-10.

[8]ASHLEY M V,DOW B D.The Use of Microsatellite Analysis in population biology: Background,methods and potential applications[M]//Molecular ecology and evolution: Approaches and applications.Switzerland: Birkh?user Verlag Basel,1994: 185-201.

[9]GOFF D J,GALVIN K,KATZ H,et al.Identification of polymorphic simple sequence repeats in the genome of the zebrafish [J].Genomics,1992,14: 200-202.

[10]SHIMODA N,KNAPIK E W,JOHN Z,et al.Zebrafish genetic map with 2000 microsatellite markers [J].Genomics,1999,58: 219-232.

[11]CARLETON K L,STREELMAN J T ,LEE B Y,et al.Rapid isolation of CA microsatellites from the tilapia genome [J].Animal Genetics,2002,33(2): 140-144.

[12]KING T L,EACKLES M S,LETCHER B H.Microsatellite DNA markers for the study of Atlantic salmon (Salmosolarr) kinship,population structure,and mixed-fishery analyses [J].Molecular Ecology Notes,2005,5(1):130-132.

[13]MCGOWAN R,DAVIDSON E A,WORAM R A,et al.Ten polymorphic microsatelite markers from Arctic charr (Salvelinusalpinus): linkage analysis and amplification in other salmonids [J].Animal Genetics,2004,35(6): 479-481.

[14]RODRIGUEZ F,REXROAD C E,PALTI Y.Characterization of twenty-four microsatellite markers for rainbow trout (Oncorhynchusmykiss) [J].Molecular Ecology Notes,2003,3(4): 619-622.

[17]DRAUCH J,ISRAEL J.Development of mew microsatellite primers for green and white sturgeon [J].Conservation Genetics,2007,10: 12-18.

[18]BRIAN L S,ROBERT J S.Microsatellite analysis of genetic variation in sturgeon: New sequences forScaphirhynchusand Acipenser [J].Fisheries Society,2000,129: 1380-1388.

[21]JAME P,LAGODAP J L.Microsatellites,from molecules to populations and back [J].Trends in Ecology and Evolution,1996,11: 424-429.

[22]QUELLER D C,STRASSMANN J E,HUGHES C R.Microsatellites and kinship [J].Trends in Ecology and Evolution,1993,8: 285-288.

[23]O′CONNELL M,WRIGHT J M.Microsatellite DNA in fishes [J].Reviews in Fish Biology and Fisheries,1997,7: 331-363.

[24]HARDY O J,VEKEMANS X.SPAGeDi: a versatile computer program to analyse spatial genetic structure at the individual or population levels [J].Molecular Ecology Notes,2002,2: 618-620.

[25]胡紅霞,董穎,朱華,等.應用熱休克和冷休克技術進行俄羅斯鱘雌核發(fā)育初試 [J].中國水產,2010,11: 82-83.

[26]BOSTIN D,WHITE R L,SKOLNICK M.Construction of a genetic linkage map in man using restriction tragment length polymorphism [J].American Journal of Hunan Genetics,1980,32: 314-331.

[27]FOPP-BAYAT D.Inheritance of microsatellite loci in polyploid Siberian sturgeon (Acipenser baeri Brandt) based on uniparental haploids [J].Aquaculture Research,2008,39(16): 1787-1792.

[28]張海發(fā),陳湘麟,舒虎,等.異源精子激發(fā)彭澤鯽雌核發(fā)育產生的子一代及親本RAPD分析 [J].應用與環(huán)境生物學報,1999,5(5): 507-511.

[29]鄒桂偉,潘光碧,汪登強,等.人工雌核發(fā)育鰱的遺傳多樣性及異源遺傳物質整入的RAPD分析 [J].水生生物學報,2004,28(2): 180-185.

[30]鄒遠超,危起偉,潘光碧,等.施氏鱘精子誘導匙吻鱘雌核發(fā)育 [J].中國水產科學,2009,16(5): 728-735.

[33]TANIGUCHI N,KIJIMA A,TAMURAT,et al.Color,growth and maturation in ploidy-manipulated fancy carp [J].Aquaculture,1986,57: 321-328.

[34]朱曉琛,劉海金,孫效文,等.微衛(wèi)星評價牙鲆雌核發(fā)育二倍體純合性 [J].動物學研究,2006,27(1): 63-67.

[35]王偉,尤鋒,高天翔,等.人工誘導牙鲆雌核發(fā)育群體的微衛(wèi)星標記分析 [J].高技術通訊,2005,15(7):107-110.

[36]王曉清,王志勇,柳小春,等.大黃魚人工誘導雌核發(fā)育后代的微衛(wèi)星標記分析 [J].遺傳,2006,28(7): 831-837.

[37]FRANCESCON A,BARBARO A,BERTOTTO D,et al.Assessment of homozygosity and fertility in meiotic gynogens of the European sea bass (DicentrachuslabraxL.) [J].Aquaculture,2005,243: 93-102.

[38]NAGY A,CSANYI V.Changes of genetic parameters in successive gynogenetic generations and some calculations for carp gynogenesis [J].Theoretical and Applied Genetics,1982,63: 105-110.

[39]FOPP-BAYAT D.Meiotic gyongenesis revealed not homogametic female sex determination system in Siberian sturgeon (AcipenserbaeriBrandt) [J].Aquaculture,2010,5: 4-7.

[40]FLYNN S R,MATSUOKA M,REITH M,et al.Gynogenesis and sex determination in shortnose sturgeon,AcipenserbrevirostrumLesuere [J].Aquaculture,2006,253,721-727.

[41]OMOTO N,MAEBAYASHI M,ADACHI S,et al.Sex ratios of triploids and gynogenetic diploids induced in the hybrid sturgeon,the bester (Husohusofemale×Acipenserruthenusmale) [J].Aquaculture,2005,245: 39-47.