產(chǎn)蛋白酶菌株Bacillus subtilis GS-1發(fā)酵條件優(yōu)化及蛋白酶水解應(yīng)用初步研究*

王方華，劉 亮，王永華，楊 博

(1.華南理工大學(xué)輕工與食品學(xué)院，廣東 廣州 510640；2.華理工大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，廣東 廣州 510641)

蛋白酶在洗滌劑、皮革制備、蛋白水解加工等行業(yè)已經(jīng)得到了廣泛的應(yīng)用[1]。經(jīng)過蛋白酶水解修飾后的蛋白，其自身的溶解性、熱穩(wěn)定性以及在酸性條件下的抗凝集性均能得到有效提高。同時(shí)，在水解過程中所產(chǎn)生的多肽和自由氨基酸，使得其自身的功能特性和營養(yǎng)價(jià)值也有所提高[2-4]。研究表明，低分子量的多肽能被腸道直接吸收且很少發(fā)生過敏反應(yīng)。另外，已報(bào)道多種具有生物學(xué)功能的多肽能增加營養(yǎng)的高效利用[5-6]。因此，在食品加工行業(yè)中，利用蛋白酶水解的方法改善食品的風(fēng)味及營養(yǎng)價(jià)值備受推崇。目前，微生物來源的蛋白酶以其自身的優(yōu)勢和特異性，得到了廣泛的應(yīng)用。其中以來源于芽孢桿菌屬及曲霉屬的微生物發(fā)酵制備蛋白酶最為常見。大部分枯草芽孢桿菌被發(fā)現(xiàn)可發(fā)酵產(chǎn)蛋白酶[1,7-12]。然而，盡管蛋白酶有著不同的微生物來源[9-15]，并表現(xiàn)出潛在應(yīng)用價(jià)值，但是目前開發(fā)的蛋白酶還不能滿足市場的多樣化需求。其中，蛋白酶制劑開發(fā)的高成本成為限制其廣泛應(yīng)用的一大瓶頸[16]。因此，高效經(jīng)濟(jì)的開發(fā)獲得更多能廣泛應(yīng)用的蛋白酶受到越來越多的關(guān)注。

出于成本考慮，目前多數(shù)的商品化蛋白酶為發(fā)酵液的粗提物。微生物發(fā)酵過程中產(chǎn)蛋白酶的活力受多種因素的影響。其中，培養(yǎng)基的標(biāo)準(zhǔn)化和發(fā)酵條件的優(yōu)化成為關(guān)鍵的決定因素。在條件優(yōu)化方面，統(tǒng)計(jì)學(xué)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)是公認(rèn)的一種快速有效的解決方法，它們提供的數(shù)學(xué)統(tǒng)計(jì)模型能提供不同變量之間的關(guān)系以及預(yù)測最大蛋白酶產(chǎn)量的信息[17]。其中，Plackett-Burman (PB) 設(shè)計(jì)和響應(yīng)面(RSM)是最常用的方法。PB設(shè)計(jì)主要用于從眾多變量中篩選出關(guān)鍵影響變量，在最初的優(yōu)化設(shè)計(jì)中顯得尤為重要[18]。響應(yīng)面是一項(xiàng)經(jīng)驗(yàn)?zāi)Ｐ图夹g(shù)，被用來評(píng)估一系列可控的實(shí)驗(yàn)因素和被觀測值之間的關(guān)系。其中涉及到的中心實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)(CCD) 常被用于分析自變量對(duì)因變量的影響[19]。實(shí)踐證明，利用以上方法優(yōu)化所得的發(fā)酵參數(shù)進(jìn)行發(fā)酵，不但生產(chǎn)成本得到減少，而且酶活力得到顯著提高[7,12,20]。

我們研究發(fā)現(xiàn)，枯草芽孢桿菌GS-1菌株在發(fā)酵過程中能產(chǎn)生胞外蛋白酶并具有水解活性。本文通過PB設(shè)計(jì)和響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)優(yōu)化了培養(yǎng)基的組成和發(fā)酵過程中的各種物理參數(shù)，以期提高其蛋白酶的活力。另外，用發(fā)酵所得的粗酶液水解不同的動(dòng)物蛋白和植物蛋白，以比較其水解效果及對(duì)底物的偏好性。以上研究結(jié)果不僅為進(jìn)一步開展該蛋白酶的生化及分子特性研究奠定了基礎(chǔ)，同時(shí)也為該蛋白酶制劑的開發(fā)應(yīng)用提供數(shù)據(jù)參考。

1 材料和方法

1.1 菌種和培養(yǎng)基

實(shí)驗(yàn)用菌株為枯草芽孢桿菌BacillussubtilisGS-1，低溫凍存的菌種首先用Luria-Bertani (LB) 培養(yǎng)基進(jìn)行種子液的培養(yǎng)。LB培養(yǎng)基組成為：蛋白胨10.0 g/L，酵母膏10.0 g/L，NaCl 10.0 g/L，pH 7.0。發(fā)酵用培養(yǎng)基組成為：玉米淀粉 (15.0 g/L)，玉米漿干粉 (15.0 g/L)，蛋白胨 (1.0 g/L)，NH4Cl (5.0 g/L)，KH2PO4(1.0 g/L)，Na2HPO4(5.0 g/L)，MgSO4·7H2O (0.2 g/L)，MnSO4(0.1 g/L)。

1.2 發(fā)酵粗酶液制備

取5 mL于37 ℃培養(yǎng)了24 h的種子培養(yǎng)液接種于含100 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的三角瓶中。37 ℃搖床培養(yǎng)48 h (200 r/min)，將發(fā)酵所得菌液8 000 r/min離心10 min獲得發(fā)酵液上清，即為蛋白酶的粗酶液，用于蛋白酶活性測定。

1.3 酶活力測定

蛋白酶活性測定參照Folin 和 Ciocalteu的方法進(jìn)行[21]，并稍作修改。取1 mL蛋白酶液加入到含有酪蛋白 (w=2％) 的磷酸緩沖液 (0.1 mol/L,pH 7.0) 中，在40 ℃恒溫水浴中反應(yīng)20 min，然后加入2 mL的三氯乙酸 (0.4 mol/L) 以終止反應(yīng)。10 000 r/min離心15 min，取1 mL離心后上清加到Na2CO3(w=10％) 和福林試劑 (0.8 mol/L) 的混合液中，于40 ℃ 孵育20 min，680 nm處測定其吸光值。酶活單位定義為在上述條件下，每分鐘水解酪蛋白產(chǎn)生1 μg 酪氨酸所需的酶量。

1.4 PB實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

選取影響蛋白酶發(fā)酵酶活的10個(gè)因素，包括培養(yǎng)基組成 (玉米淀粉，玉米漿干粉，蛋白胨，NH4Cl,KH2PO4,Na2HPO4,MgSO4·7H2O,MnSO4) 和發(fā)酵參數(shù) (起始pH和培養(yǎng)溫度)，用于關(guān)鍵變量的篩選。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)如表1所示，10個(gè)變量分別通過12次實(shí)驗(yàn)進(jìn)行評(píng)價(jià)分析，每個(gè)變量通過兩個(gè)水平 (低水平-1和高水平+1) 來檢測。響應(yīng)值通過蛋白酶活力 (3次實(shí)驗(yàn)的平均值) 來衡量。每個(gè)變量的顯著性通過P值和顯著水平確定。

1.5 最陡爬坡實(shí)驗(yàn)及相應(yīng)面優(yōu)化

1.6 蛋白水解實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)選取大豆蛋白，蠶蛹蛋白，蝦蛋白 (購自北京奧博星生物技術(shù)有限公司) 作為水解底物來考查蛋白酶的水解活力。酶與底物比例 (E/S) 為5％，于50 ℃pH 7.0的條件下反應(yīng)6 h，每隔1 h取樣，沸水中加熱處理20 min后，10 000 r/min離心30 min，上清用0.22 μm的濾膜過濾，即獲得蛋白水解液，于-70 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩５鞍姿庖旱乃舛?(DH)、水解液中多肽的分子量分布及自由氨基酸組成參照文獻(xiàn)中報(bào)道的方法進(jìn)行。水解度指蛋白水解過程中釋放的自由氨基酸的含量，通過α氨基氮與總氮的比值來計(jì)算。氨基氮用甲醛滴定法測定[23]，總氮用凱氏定氮法測定[24]。水解產(chǎn)物的分子量分布通過分子篩的方法測定[25]。氨基酸組成由反相高效液相色譜方法測定。每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0進(jìn)行顯著性分析 (P<0.05)。

2 結(jié)果和討論

2.1 PB實(shí)驗(yàn)確定影響發(fā)酵產(chǎn)蛋白酶活力的關(guān)鍵變量

發(fā)酵過程中產(chǎn)蛋白酶的活力主要受培養(yǎng)基組成 (如碳源、氮源、金屬離子) 以及發(fā)酵參數(shù) (如通氣量、培養(yǎng)溫度、發(fā)酵時(shí)間等) 的影響[15]。因此，本研究確定了10個(gè)可能的因素并從中篩選出最關(guān)鍵的影響變量 (表1)?；赑B實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，得到相應(yīng)的效應(yīng)值、t值和P值等統(tǒng)計(jì)結(jié)果 (表2)。其中，效應(yīng)值用來反應(yīng)變量的濃度水平，正效應(yīng)表明變量的濃度水平過低，負(fù)效應(yīng)表明變量的濃度水平過高。從表2中可以看出，X2(玉米淀粉)，X3(蛋白胨)，X5(KH2PO4)，X6(Na2HPO4) 和X7(MgSO4·7H2O) 都表現(xiàn)為正效應(yīng)。因此，在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中選擇它們較高的水平。而其它因素表現(xiàn)為負(fù)效應(yīng)，則選取它們較低的水平。從變量的P值可以看出，X4(NH4Cl)，X9(起始pH值) 和X10(培養(yǎng)溫度) 的可信度大于90％，因此確定這3個(gè)變量為關(guān)鍵變量。由此得到的模型方程為：

Y1= 149- 8.48X1+ 8.62X2+ 4.47X3-11.8X4+ 3.97X5+ 4.54X6+ 4.12X7-4.26X8-15.4X9-11.3X10,方程中Y1為預(yù)測的酶活力，Xi為變量。決定系數(shù) (R2) 為0.997 2，調(diào)整系數(shù) (adjR2) 為0.969 3，表明該數(shù)學(xué)模型能較好的表征實(shí)驗(yàn)的實(shí)際情況。

表1 PB實(shí)驗(yàn)矩陣設(shè)計(jì)篩選影響蛋白酶活力的關(guān)鍵因素1)

表2 PB實(shí)驗(yàn)結(jié)果的效應(yīng)評(píng)價(jià)

2.2 最陡爬坡實(shí)驗(yàn)

最陡爬坡實(shí)驗(yàn)是通過線性效應(yīng)的大小和符號(hào)來確定預(yù)測更高響應(yīng)值的方向。步伐開始于當(dāng)前設(shè)計(jì)區(qū)間的中心點(diǎn)并向外延伸。通過選取沿步伐不斷延伸的不同區(qū)間點(diǎn)來確定一系列實(shí)驗(yàn)[26]。本實(shí)驗(yàn)中，由于3個(gè)關(guān)鍵變量皆表現(xiàn)為負(fù)效應(yīng)，因此，爬坡實(shí)驗(yàn)從PB實(shí)驗(yàn)的中心點(diǎn)開始，并沿變量水平減少的方向進(jìn)行。通過相應(yīng)的計(jì)算公式[27]，X4,X9和X10的步長分別為-0.738,-0.8 和-2.8。如表3中所示，共設(shè)計(jì)了6組實(shí)驗(yàn)用以確定中心復(fù)合實(shí)驗(yàn)的中心點(diǎn)。其中，第4組實(shí)驗(yàn)中得到了酶活性的最大值。因此，確定其中心點(diǎn)為：NH4Cl質(zhì)量濃度3.411 g/L，起始pH 5.1，培養(yǎng)溫度26.1 ℃。

2.3 響應(yīng)面分析

本研究中，中心復(fù)合實(shí)驗(yàn)被用于蛋白酶發(fā)酵的響應(yīng)面分析。結(jié)果如表4所示，響應(yīng)值 (Y) 為3次實(shí)驗(yàn)的平均值，預(yù)測的響應(yīng)值根據(jù)數(shù)學(xué)模型計(jì)算獲得。通過實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)軟件確定的二次方程為：

表3 最陡爬坡實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)以及相關(guān)結(jié)果

表 4 蛋白酶活力的中心復(fù)合實(shí)驗(yàn)矩陣設(shè)計(jì)及響應(yīng)面分析1)

表5 蛋白酶活性優(yōu)化的模型適配和方差分析結(jié)果1)

為進(jìn)一步優(yōu)化發(fā)酵產(chǎn)蛋白酶的活力，等高線圖和三維立體圖被用于對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。它們能更直觀的顯示不同變量以及它們的交互作用對(duì)響應(yīng)值的影響。等高線的形狀能夠反應(yīng)交互作用是否顯著。橢圓表示交互作用顯著，而非橢圓則相反。本實(shí)驗(yàn)在確定一個(gè)因素在最優(yōu)水平條件下，另外兩個(gè)因素的相互作用進(jìn)行觀察。等高線圖 (圖1a，圖2a，圖3a) 清晰的表明，NH4Cl質(zhì)量濃度和起始pH之間的交互作用顯著，而NH4Cl質(zhì)量濃度和培養(yǎng)溫度，以及起始pH和培養(yǎng)溫度之間交互作用不顯著。該結(jié)果和表5中的分析結(jié)果一致，表明這些結(jié)果真實(shí)反應(yīng)了不同變量之間的相互作用。同時(shí)，從三維立體圖 (圖1b，圖2b，圖3b) 可以看出，隨著NH4Cl質(zhì)量濃度和起始pH的增加及培養(yǎng)溫度的降低，蛋白酶活力得到顯著提高。

當(dāng)確定起始pH為5.6時(shí)，在橢圓中心獲得酶活力的最大值，相應(yīng)的NH4Cl質(zhì)量濃度和培養(yǎng)溫度分別為3.8 g/L和22.4 ℃。如圖1-3所示，每一個(gè)圖都標(biāo)注了最大酶活力值和相應(yīng)的變量值。同時(shí)，通過實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)軟件得出的數(shù)學(xué)方程，也得到了預(yù)測的最大酶活力值。即當(dāng)NH4Cl質(zhì)量濃度為3.768 g/L，起始pH為5.6，培養(yǎng)溫度為22.4 ℃時(shí)，預(yù)測的最大酶活力為365.348 U/mL，與響應(yīng)面圖中獲得的優(yōu)化值一致。同時(shí)，我們進(jìn)行了模型的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，在最優(yōu)條件下，通過3次平行實(shí)驗(yàn)，獲得的實(shí)際酶活力值為372.814 U/mL。實(shí)際值與預(yù)測值非常接近，表明該模型能用于發(fā)酵過程的預(yù)測。

圖1 發(fā)酵溫度確定為22.4 ℃時(shí)，NH4Cl質(zhì)量濃度和起始pH對(duì)枯草芽孢桿菌蛋白酶活力影響的等高線圖 (a) 和響應(yīng)面圖 (b)

圖2 起始pH確定為5.6時(shí)，NH4Cl質(zhì)量濃度和發(fā)酵溫度對(duì)枯草芽孢桿菌蛋白酶活力影響的等高線圖 (a) 和響應(yīng)面圖 (b)

2.4 蛋白酶水解實(shí)驗(yàn)

蛋白酶發(fā)酵液對(duì)不同底物的水解度如圖4所示。對(duì)不同的底物，蛋白酶表現(xiàn)出不同的水解活性。對(duì)于植物蛋白 (大豆蛋白)來說，不同時(shí)間點(diǎn)取樣測得的水解度差異不大 (P>0.05)，最高水解度在水解時(shí)間為6 h時(shí)獲得 (約7％)。而與水解植物來源的蛋白相比，該蛋白酶對(duì)于動(dòng)物來源的蛋白 (蠶蛹蛋白，蝦蛋白) 的水解更顯優(yōu)勢。在水解6 h后，蝦蛋白獲得的最大水解度為14.4％。蛋白酶對(duì)動(dòng)、植物蛋白表現(xiàn)不同的水解度，推測其原因主要有兩點(diǎn)，一是動(dòng)、植物蛋白的氨基酸組成不同，二是植物蛋白本身含有的多糖或其它成分，可能限制了蛋白酶對(duì)蛋白的水解，從而導(dǎo)致低水解度。

不同水解組分的肽段分子量分布結(jié)果表明水解產(chǎn)物都富含小相對(duì)分子質(zhì)量片段 (<1 000)，分別為94.3％ (蝦蛋白)，91.1％ (蠶蛹蛋白)，85.7％ (大豆蛋白) (圖4b)。另外，動(dòng)物蛋白水解液中的小分子片段所占比例 (<300，蠶蛹蛋白36.8％；蝦蛋白35.1％) 比植物蛋白水解物中的小分子片段 (<300，大豆蛋白18.7％)(P<0.05)更多。動(dòng)物蛋白水解產(chǎn)物較高的小肽分布與蛋白酶對(duì)動(dòng)物蛋白所表現(xiàn)出較高的水解活性結(jié)果相吻合。Quist 等發(fā)現(xiàn)蛋白在水解過程中首先被內(nèi)切酶水解成較大的分子肽段，然后經(jīng)外切酶作用，水解成更小的片段[4]。水解產(chǎn)物中眾多的小肽表明粗酶液既有內(nèi)肽酶活性又有外肽酶活性。因此，下一步工作將確定粗酶液中蛋白酶的組成及其在水解過程中的功能。

圖4 蛋白酶水解不同蛋白的水解度(a)和不同水解產(chǎn)物中肽段的相對(duì)分子質(zhì)量分布(b)

針對(duì)不同底物的水解產(chǎn)物自由氨基酸組成如表6所示。該結(jié)果與Benjakul 和 Morrisey[28]獲得的結(jié)果相似。底物蛋白經(jīng)蛋白酶水解作用后，自由氨基酸含量得到顯著提高。表6中結(jié)果表明，Glu,Val,Ile,Leu,Phe,Arg等氨基酸的含量得到顯著提高，說明蛋白酶易于水解由這些氨基酸組成的化學(xué)鍵，這些氨基酸的序列結(jié)構(gòu)和含量決定了底物蛋白的最終水解度。另外，水解產(chǎn)物中較高的必需氨基酸 (His,Arg,Thr,Tyr,Val,Ile,Leu,Phe) 含量也表明水解物營養(yǎng)豐富。蛋白的氨基酸組成是分析其營養(yǎng)成份的關(guān)鍵因素之一。任何成份的營養(yǎng)價(jià)值依賴于蛋白滿足有機(jī)體所需必須氨基酸的能力[29]。提高水解產(chǎn)物中必須氨基酸的含量是提升水產(chǎn)養(yǎng)殖和動(dòng)物、人類營養(yǎng)的一個(gè)有效途徑。因此，利用枯草芽孢桿菌GS-1發(fā)酵所產(chǎn)蛋白酶對(duì)不同底物進(jìn)行水解加工在食品加工行業(yè)中具有巨大的應(yīng)用價(jià)值。

表6 不同底物蛋白水解液的自由氨基酸組成

3 結(jié) 論

本研究通過一系列統(tǒng)計(jì)學(xué)方法成功的對(duì)枯草芽孢桿菌GS-1產(chǎn)蛋白酶的發(fā)酵過程進(jìn)行了優(yōu)化，使得蛋白酶的最高酶活力達(dá)到372.814 U/mL。雖然與其它已報(bào)道的菌株產(chǎn)蛋白酶的活力相比并不是很高，但這也是一個(gè)有意義的嘗試。統(tǒng)計(jì)優(yōu)化及實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證的結(jié)果表明該方法用于菌株發(fā)酵產(chǎn)蛋白酶活力的優(yōu)化是切實(shí)可行的。至于其酶活力不高，其原因可能與菌株自身的特性有關(guān)。本文的研究方法和結(jié)果將為該菌株所產(chǎn)蛋白酶的深入研究提供方法和數(shù)據(jù)上的參考。然而，由于粗酶液中蛋白酶的成份相對(duì)復(fù)雜，不便于開展蛋白酶的相關(guān)酶學(xué)性質(zhì)研究。因此，下一步將集中開展蛋白酶的純化以及優(yōu)化蛋白酶的水解條件工作，以便于其在蛋白水解工業(yè)上的應(yīng)用。

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