一種用于黃曲霉高質(zhì)量總RNA提取方法與應(yīng)用*

林劍青，王成成，肖春華，陳國(guó)華，賀竹梅

(中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院水產(chǎn)品安全教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣東 廣州 510275)

絲狀真菌黃曲霉Aspergillusflavus所產(chǎn)生的黃曲霉毒素(aflatoxins)是一組具有強(qiáng)致癌性和免疫毒性的真菌毒素，對(duì)人類健康產(chǎn)生極大的危害。半個(gè)世紀(jì)以來(lái)，科學(xué)家們應(yīng)用各種生物學(xué)技術(shù)，對(duì)黃曲霉次級(jí)代謝相關(guān)基因尤其是黃曲霉毒素代謝相關(guān)基因展開(kāi)了大量的研究[1-2]。

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，Northern雜交、cDNA文庫(kù)構(gòu)建、RT-PCR擴(kuò)增、熒光定量PCR、芯片雜交、轉(zhuǎn)錄組測(cè)序等技術(shù)被越來(lái)越多地應(yīng)用于黃曲霉生長(zhǎng)發(fā)育及次級(jí)代謝機(jī)制的研究中，這也對(duì)所提取的RNA的質(zhì)量提出了更高的要求。然而，絲狀真菌細(xì)胞具有由幾丁質(zhì)、葡聚糖、脂類和肽類組成的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)，嚴(yán)重影響RNA提取效率。因此，通常用于動(dòng)物細(xì)胞、細(xì)菌和酵母中的RNA提取方法很難直接用于黃曲霉RNA的提取[3]。同時(shí)，真菌細(xì)胞中含有大量的RNase和次級(jí)代謝產(chǎn)物，提取RNA的過(guò)程中必須抑制內(nèi)源RNase的活性，同時(shí)除去多糖、多酚、蛋白質(zhì)以及細(xì)胞壁殘骸[3-4]，否則不僅影響RNA的產(chǎn)量和完整性，還會(huì)對(duì)后續(xù)實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生直接的影響。

針對(duì)以上絲狀真菌的特征，其RNA提取包括兩個(gè)主要關(guān)鍵步驟：細(xì)胞壁的破壞和RNA抽提純化。破壞真菌細(xì)胞壁的方法主要包括：研缽研磨法、玻璃珠研磨法、酶解法、超聲波降解法、微波輻射法、加熱法等[3-6]；根據(jù)抽提緩沖液的不同，RNA抽提的方法可以分為：TRIzol法、CTAB法、異硫氰酸胍法、SDS/酚抽提法等[4, 7-10]，另外還可以使用過(guò)柱的方法對(duì)RNA進(jìn)行分離純化。

本文以黃曲霉菌絲為材料，使用對(duì)RNA完整性破壞比較小的研缽研磨法破壞細(xì)胞壁，在參考了多種RNA抽提方法的基礎(chǔ)上，對(duì)熱酚法做了較大的改進(jìn)，并使用這種改進(jìn)的TES熱酚法提取黃曲霉總RNA，用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)了RNA的產(chǎn)量和質(zhì)量，并且通過(guò)RT-PCR、RNA測(cè)序?qū)μ崛〉目俁NA質(zhì)量進(jìn)行了進(jìn)一步檢驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明這種TES熱酚法是一種有效的適合黃曲霉總RNA提取的方法。

1 材料與方法

1.1 試劑和用具的準(zhǔn)備

用于RNA提取的研缽、藥匙、鑷子、試劑瓶等均在180 ℃條件烘烤30 min；所用槍頭以及離心管均在121 ℃高壓滅菌30 min，烘干備用；所配試劑均用DEPC(Sigma)處理過(guò)夜或者用DEPC水進(jìn)行配制；所用酚為水飽和酚(Solarbio)。

1.2 真菌材料的準(zhǔn)備

實(shí)驗(yàn)所用黃曲霉菌種AspergillusflavusNRRL 3357由本實(shí)驗(yàn)室保存。將3.3×107個(gè)黃曲霉孢子接入裝有100 mL PDB(Difco)培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，30 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)72 h，培養(yǎng)物真空抽濾得到菌絲，稱取0.2 g菌絲，置于用液氮預(yù)冷的研缽中，用經(jīng)過(guò)液氮預(yù)冷的杵子充分研磨，直至菌絲成粉末狀，立即進(jìn)行RNA抽提操作。

1.3 改良的TES熱酚法[10-11]

具體步驟如下：①將充分研磨的菌絲粉末加入到含有4 mL TES提取緩沖液(10 mmol/L Tris-HCl，10 mmol/L EDTA，0.5% SDS)和4 mL水飽和酚的預(yù)冷的10 mL離心管中；②劇烈振蕩離心管后，65 ℃水浴15 min，其間每隔2～3 min顛倒混勻一次；③置于冰上充分冷卻后，4 ℃、11 000 r/min離心10 min；④轉(zhuǎn)移上層水相至另一盛有4 mL酚/氯仿/異戊醇(25∶24∶1)并預(yù)冷的10 mL離心管中，劇烈振蕩，4 ℃、11 000 r/min離心10 min；⑤重復(fù)步驟④操作一次；⑥取上層水相至另一離心管中，加等體積氯仿/異戊醇(24∶1)，劇烈震蕩，4 ℃、11 000 r/min離心10 min；⑦取上層水相至新的離心管中，加入等體積預(yù)冷的異丙醇，-20 ℃沉淀過(guò)夜；⑧4 ℃、11 000 r/min離心15 min，棄上清，用預(yù)冷的φ=75%乙醇和無(wú)水乙醇分別各洗滌沉淀一次，室溫下干燥；⑨用200 μL DEPC處理過(guò)的ddH2O溶解沉淀，-70 ℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 RNA完整性以及純度檢測(cè)

1.4.1 紫外分光光度計(jì)(NanoVue，GE Healthcare)測(cè)定樣品A260和A280值，以檢驗(yàn)其濃度和純度，每個(gè)樣品重復(fù)3次。

1.4.2 甲醛變性膠電泳用1×MOPS(20 mmol/L MOPS, 50 mmol/L CH3COONa, 10 mmol/L EDTA，pH 7.0)作為電泳緩沖液，配制瓊脂糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.2%的甲醛變性膠，80 V電泳40 min。電泳結(jié)束后，用凝膠成像儀(天能公司)成像。

1.4.3 將TES熱酚法提取獲得的RNA使用Gibogreen染料法進(jìn)行定量，三個(gè)平行樣品按照相同質(zhì)量進(jìn)行混合之后，在安捷倫2100生物分析儀上使用RNA Nano 6000 chip進(jìn)行檢測(cè)分析。

1.5 樣品中基因組DNA的去除以及cDNA第一條鏈合成

使用無(wú)RNase的DNase I(Takara)去除樣品中的DNA；應(yīng)用Invitrogen公司“用于qRT-PCR的M-MLV第一鏈合成系統(tǒng)”試劑盒提供的方法進(jìn)行cDNA第一條鏈的合成。

1.6 RT-PCR

根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)[12]，選取黃曲霉毒素代謝通路中的aflR(678 bp)和aflW(911 bp)基因，設(shè)計(jì)引物對(duì)，aflR：5’-ATTCAACTCGGCGACCATCA-3，5’-TGCTCAGCAAGTAGCCATCC-3’；aflW：5’-GAAGACCGCGGAGAATGG-3’，5’-GGCCCAATGACACTGCC-3’。PCR體系如下：10 μL 2×HS Reaction Mix(東盛生物)，正反向引物各0.5 μmol/L，cDNA約2 μg，0.2 μL HS Taq，加無(wú)菌水至20 μL。在下述PCR程序上進(jìn)行擴(kuò)增：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s、55 ℃ 45 s、72 ℃ 60 s(35循環(huán))；72 ℃ 7 min；4 ℃停止反應(yīng)。

1.7 測(cè)序文庫(kù)的構(gòu)建與轉(zhuǎn)錄組測(cè)序

RNA檢測(cè)合格后，使用Illumina?TruSeqTMRNA Sample Preparation Kit構(gòu)建轉(zhuǎn)錄組測(cè)序文庫(kù)，并在安捷倫2100生物分析儀上使用DNA 1000 chip檢測(cè)文庫(kù)質(zhì)量，在確保文庫(kù)合格后，使用Genome Analyzer IIx高通量測(cè)序，并對(duì)測(cè)序質(zhì)量進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 總RNA的純度和完整性檢測(cè)

TES熱酚法提取的總RNA樣品經(jīng)紫外分光光度計(jì)檢測(cè)，得到的A260/A280比值較穩(wěn)定，分布在2.1左右(2.012～2.184)，說(shuō)明RNA樣品幾乎不存在污染或者其污染可以忽略不計(jì)[13]。

在總的RNA中大約有98%～99%的都是核糖體RNA(rRNA)[14]；因此，總RNA的完整性可以通過(guò)rRNA的完整性體現(xiàn)，而rRNA的完整性可以通過(guò)φ=1.2%甲醛變性膠的凝膠電泳檢測(cè)。由電泳結(jié)果可以看出，運(yùn)用TES熱酚法提取的黃曲霉總RNA的28S、18S rRNA條帶清晰可見(jiàn)，無(wú)彌散現(xiàn)象，而且28S rRNA條帶亮度約為18S rRNA條帶的2倍(圖1)，說(shuō)明沒(méi)有發(fā)生RNA的降解，其總RNA樣品的完整性較好。

鑒于以上結(jié)果，進(jìn)一步采用RT-PCR和轉(zhuǎn)錄組測(cè)序?qū)ES熱酚法提取的黃曲霉菌總RNA的質(zhì)量進(jìn)行檢驗(yàn)。

圖1 TES熱酚法提取的黃曲霉菌絲總RNA電泳圖

2.2 RT-PCR對(duì)TES熱酚法提取的黃曲霉總RNA質(zhì)量的驗(yàn)證

為了驗(yàn)證TES熱酚法提取的黃曲霉RNA的質(zhì)量，以其為模板，我們對(duì)黃曲霉毒素代謝基因簇中aflR和aflW基因進(jìn)行了RT-PCR特異性擴(kuò)增。結(jié)果顯示，以TES熱酚法所提取的RNA為模板，進(jìn)行RT-PCR，分別能擴(kuò)增出清晰的、符合預(yù)期大小的(678 bp和911 bp)特異性條帶，且沒(méi)有非特異性條帶的出現(xiàn)(圖2)，表明我們所分離出的總RNA沒(méi)有DNA污染。

圖2 以TES熱酚法提取的黃曲霉總RNA為模板的RT-PCR擴(kuò)增電泳圖

2.3 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序驗(yàn)證TES熱酚法提取的黃曲霉總RNA的質(zhì)量

2.3.1 RNA質(zhì)量濃度和質(zhì)量檢測(cè)：用于制備轉(zhuǎn)錄組文庫(kù)的總RNA樣品完整度必須達(dá)到6.0以上的RIN(RNA integrity number)值，A260/A280的比值應(yīng)在1.8～2.2的范圍內(nèi)。普通UV定量法容易產(chǎn)生嚴(yán)重偏差，我們使用Gibogreen染料法對(duì)RNA質(zhì)量濃度重新進(jìn)行了定量分析，發(fā)現(xiàn)用TES熱酚法提取的3個(gè)RNA樣品的A260/A280均在2.1左右，純度較高，質(zhì)量濃度達(dá)到400 ng/μL以上，RNA總量符合轉(zhuǎn)錄組測(cè)序要求。使用安捷倫2100生物分析儀檢測(cè)RNA完整性，RIN>6，S28/S18 = 2.3，表明樣品完整性較高。將3個(gè)樣品等量混合后，再次檢測(cè)其質(zhì)量濃度和完整性，樣品完全合格(表1)，可以用于轉(zhuǎn)錄組文庫(kù)構(gòu)建。

2.3.2 轉(zhuǎn)錄組文庫(kù)質(zhì)量檢測(cè)：RNA檢測(cè)合格后，使用Illumina?TruSeqTMRNA Sample Preparation Kit構(gòu)建轉(zhuǎn)錄組測(cè)序文庫(kù)，文庫(kù)體積為20 μL，質(zhì)量濃度為10.58 ng/μL，在安捷倫2100生物分析儀上使用DNA 1000 chip對(duì)文庫(kù)進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明，黃曲霉轉(zhuǎn)錄組文庫(kù)質(zhì)量如圖3所示，都分布在(380±50)bp，沒(méi)有100 bp以下的吸收峰(這種大小的吸收峰可由引物二聚體純化不徹底引起)，符合測(cè)序要求，表明可以進(jìn)行高通量測(cè)序。

表1 TES熱酚法提取的總RNA的質(zhì)量濃度和質(zhì)量檢測(cè)

圖3 轉(zhuǎn)錄組文庫(kù)質(zhì)量檢測(cè)

2.3.3 測(cè)序質(zhì)量分析 使用Genome Analyzer IIx對(duì)轉(zhuǎn)錄組文庫(kù)進(jìn)行高通量雙末端測(cè)序，讀長(zhǎng)為2×115 bp。進(jìn)行reads過(guò)濾，去除序列中測(cè)序質(zhì)量較差部分后保留長(zhǎng)度大于50 bp的reads，過(guò)濾后reads的長(zhǎng)度分布見(jiàn)圖4，大部分過(guò)濾后的reads長(zhǎng)度仍在115 bp左右。過(guò)濾后有效數(shù)據(jù)量為2.49 G。對(duì)有效數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)90.50%的reads可以唯一定位到黃曲霉基因組上，分析發(fā)現(xiàn)，這些reads在基因上呈較均勻的分布，91%基因的reads覆蓋率超過(guò)90%，說(shuō)明reads對(duì)大部分表達(dá)基因的覆蓋是完整的。

圖4 測(cè)序長(zhǎng)度分布統(tǒng)計(jì)分析

3 討論與結(jié)論

本文采用液氮和研缽對(duì)黃曲霉菌絲進(jìn)行研磨的方法破壞其細(xì)胞壁，與玻璃珠研磨法相比，這種方法價(jià)格較為低廉，適用于RNA的大規(guī)模提取，也避免了超聲波降解法和微波輻射法中所存在的破壞RNA的風(fēng)險(xiǎn)，同時(shí)也不需要像酶解法一樣引入新的蛋白質(zhì)，從而在不引入新雜質(zhì)的條件下最大程度地保證了RNA的產(chǎn)量和完整性。

由于在完整的細(xì)胞內(nèi)，多糖多酚類化合物和一些未知次級(jí)代謝產(chǎn)物在空間上與核酸是分離的，但當(dāng)組織被研磨，細(xì)胞破碎后，這些物質(zhì)就會(huì)與RNA相互作用[15]，所以當(dāng)我們?cè)谄茐募?xì)胞結(jié)構(gòu)之后就應(yīng)盡快用酚氯仿抽提以將多糖多酚類物質(zhì)與RNA分離。本文所使用的TES熱酚法在傳統(tǒng)熱酚法的基礎(chǔ)上進(jìn)行了改進(jìn)。傳統(tǒng)熱酚法中所使用的裂解緩沖液是SDS和醋酸鈉[10]，而在TES熱酚法中將裂解緩沖液換成了Tris-HCl、EDTA和SDS。SDS主要用于蛋白質(zhì)的變性和促使RNases失活；EDTA是一種金屬離子螯合劑，能夠進(jìn)一步抑制RNases的活性[16-17]。酸性酚與裂解緩沖液合用，能夠在高溫及劇烈震蕩的條件下有效的破壞細(xì)胞，提取RNA[18-19]。由于RNA在堿性條件下對(duì)OH-離子誘導(dǎo)的單鏈裂解更加敏感[20]而導(dǎo)致其極不穩(wěn)定，因此，我們用酸性水飽和酚(pH 5.2)來(lái)維持整個(gè)提取過(guò)程的酸性環(huán)境。氯仿能夠使蛋白質(zhì)變性，異戊醇能夠減少蛋白質(zhì)在變性過(guò)程中的起泡現(xiàn)象，在RNA提取過(guò)程中先后使用酚、酚/氯仿/異戊醇、氯仿/異戊醇進(jìn)行抽提，能夠充分去除蛋白質(zhì)等雜質(zhì)，從而保證所提取RNA的濃度、純度和完整性，以滿足后續(xù)對(duì)RNA質(zhì)量有較高要求的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)，且此法所用試劑相對(duì)于Trizol試劑盒法價(jià)格更低廉，適用于大批量的RNA提取。

本文對(duì)TES熱酚法提取的RNA進(jìn)行了PCR擴(kuò)增和轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。通過(guò)PCR可以擴(kuò)增出預(yù)期大小的特異性條帶。在轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的文庫(kù)構(gòu)建和高通量測(cè)序過(guò)程中的一系列質(zhì)量控制實(shí)驗(yàn)均表明，TES熱酚法所提取的RNA質(zhì)量較高，用它所構(gòu)建的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序文庫(kù)質(zhì)量符合測(cè)序要求。轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果分析表明，轉(zhuǎn)錄組測(cè)序?qū)嶒?yàn)獲得了較高質(zhì)量的數(shù)據(jù)，說(shuō)明TES熱酚法所提取的RNA濃度、純度和完整性較高。

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